Arten der Chromatographie (Definition, Prinzip, Schritte, Verwendungen)

Arten der Chromatographie (Definition, Prinzip, Schritte, Verwendungen)

Chromatographie-Definition

Chromatographie ist eine wichtige biophysikalische Technik, die die Trennung, Identifizierung und Reinigung der Komponenten einer Mischung für qualitative und quantitative Analysen ermöglicht.

  • Eine breite Palette von chromatographischen Verfahren nutzt Unterschiede in Größe, Bindungsaffinität, Ladung und anderen Eigenschaften, um Materialien zu trennen.
  • Es ist ein leistungsstarkes Trennwerkzeug, das in allen Wissenschaftszweigen eingesetzt wird und oft das einzige Mittel ist, um Komponenten aus komplexen Gemischen zu trennen.
  • Die Chromatographie ist eine sehr nützliche Technik, da sie die Trennung von Komponenten einer Mischung auf der Grundlage ihrer Art, Struktur, Größe und anderer Eigenschaften ermöglicht.
  • Die Chromatographie basiert im Allgemeinen auf dem Prinzip, dass Komponenten einer Mischung getrennt werden, wenn die zu einer mobilen Phase hinzugefügte Mischung durch eine stationäre Phase (die meistens eine feste Oberfläche ist) bewegt wird, was dazu führt, dass einige Komponenten der Mischung an die stationäre Phase. Gleichzeitig wird der Rest mit der mobilen Phase weitergegeben.
  • Somit gibt es zwei wesentliche Komponenten aller Chromatographietechniken.

Was ist eine stationäre Phase?

Die stationäre Phase in der Chromatographie ist die Phase, die entweder ein fester oder flüssiger Partikel ist, der an eine Glas- oder Metalloberfläche gebunden ist und an der die Komponenten des zu trennenden Gemischs selektiv absorbiert werden.

  • Der Begriff stationär bezieht sich darauf, dass diese Phase stationär bleibt, während sich die andere Phase bewegt.
  • Die meisten als stationäre Phasen verwendeten Substanzen sind porös und ermöglichen so die Anlagerung von Komponenten während der Chromatographie.
  • Welche stationäre Phase für ein chromatographisches Verfahren zu wählen ist, hängt von der Art der zu trennenden Komponenten und der Art der Chromatographie ab.
  • Je nach Art der Chromatographie-Gelbeads werden als stationäre Phase dünnes einheitliches Papier, Kieselsäure, Glas, einige Gase oder sogar flüssige Komponenten verwendet.

Was ist die mobile Phase?

Die mobile Phase in der Chromatographie ist die Phase, die entweder flüssig oder gasförmig ist und durch ein chromatographisches System geleitet wird, in dem die Komponenten der Mischung mit unterschiedlichen Raten getrennt werden, indem sie an die stationäre Phase adsorbiert werden.

  • Die mobile Phase ist das Lösungsmittel, das die Mischung trägt, während sie sich die stationäre Phase hinunter bewegt.
  • Der Begriff mobil bedeutet, dass sich die Phase im chromatographischen System nach unten bewegt, während die andere Phase stationär bleibt.
  • Je nach Art der zu trennenden Komponenten und Art der Chromatographie werden als mobile Phasen verwendete Substanzen für ein chromatographisches Verfahren ausgewählt.
  • Alkohol, Wasser, Essigsäure, Aceton oder einige Gase sind die üblicherweise verwendeten mobilen Phasen in verschiedenen chromatographischen Techniken.

Arten der Chromatographie

1. Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die Komponenten einer Mischung basierend auf ihrer Affinität zur stationären Phase des Systems getrennt werden.

Prinzip der Affinitätschromatographie

  • Diese Chromatographietechnik basiert auf dem Prinzip, dass Komponenten einer Mischung getrennt werden, wenn das Element mit einer Affinität zur stationären Phase an die stationäre Phase bindet. Im Gegensatz dazu werden andere Komponenten mit der mobilen Phase eluiert.
  • Das Substrat/Ligand wird an die stationäre Phase gebunden, so dass die reaktiven Stellen für die Bindung von Komponenten freigelegt werden.
  • Nun wird die Mischung durch die mobile Phase geleitet, wo die Komponenten mit Bindungsstellen für das Substrat an das Substrat auf der stationären Phase binden, während die restlichen Komponenten mit der mobilen Phase eluiert werden.
  • Die an die stationäre Phase gebundenen Komponenten werden dann durch Änderung des pH-Werts, der Ionenstärke oder anderer Bedingungen eluiert.

Schritte der Affinitätschromatographie

  • Die Säule wird vorbereitet, indem sie mit einem festen Träger wie Agarose oder Cellulose beladen wird, auf dem das Substrat/Ligand mit dem Spacer-Arm befestigt wird.
  • Die die Mischung enthaltende mobile Phase wird mit konstanter Geschwindigkeit in die Säule gegossen.
  • Sobald das Verfahren abgeschlossen ist, wird der Ligand-Molekül-Komplex aus der stationären Phase eluiert, indem die Bedingungen geändert werden, die die Trennung von Ligand und Komponenten der Mischung begünstigen.

Anwendungen der Affinitätschromatographie

  • Die Affinitätschromatographie wird als Stapeltrenntechnik von Enzymen und anderen Proteinen verwendet.
  • Dieses Prinzip wird auch bei den in vitro Antigen-Antikörper-Reaktionen angewendet.
  • Diese Technik wird zur Trennung von Komponenten sowie zur Entfernung von Verunreinigungen aus einem Gemisch verwendet.
  • Die Affinitätschromatographie kann beim Nachweis von Mutationen und Nukleotidpolymorphismen in Nukleinsäuren verwendet werden.

Beispiele für Affinitätschromatographie

  • Die Reinigung von Coli-β-Galactosidase aus einem Proteingemisch unter Verwendung der p-Aminophenyl-1-thio-β-D-galactopyranosyl-Agarose als Affinitätsmatrix.
  • Die Entfernung von überschüssigem Albumin und α 2 -Makroglobulin aus dem Serumalbumin.

2. Anionenaustauschchromatographie

Anionenaustauschchromatographie ist die Trenntechnik für negativ geladene Moleküle durch deren Wechselwirkung mit der positiv geladenen stationären Phase in Form von Ionenaustauscherharz.

Prinzip der Anionenaustauschchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der Anziehung von positiv geladenem Harz und dem negativ geladenen Analyten. Hier findet der Austausch positiv geladener Ionen statt, um die negativ geladenen Moleküle zu entfernen.
  • Die stationäre Phase wird zuerst mit positiven Ladungen beschichtet, wo die Komponenten der Mischung mit negativen Ladungen binden.
  • Ein Anionenaustauscherharz mit einer höheren Affinität zu den negativ geladenen Komponenten bindet dann die Komponenten und verdrängt das positiv geladene Harz.
  • Der Anionenaustauscherharz-Komponenten-Komplex wird dann unter Verwendung verschiedener Puffer entfernt.

Schritte der Anionenaustauschchromatographie

  • Als stationäre Phase wird eine mit positiv geladenem Harz gefüllte Säule verwendet.
  • Die Mischung mit den geladenen Partikeln wird dann die Säule entlang geleitet, wo die negativ geladenen Moleküle an die positiv geladenen Harze binden.
  • Das Anionenaustauscherharz wird dann durch die Säule geleitet, wo sich die negativ geladenen Moleküle nun an das Anionenaustauscherharz binden und das positiv geladene Harz verdrängen.
  • Nun wird ein geeigneter Puffer auf die Säule aufgetragen, um den Komplex aus Anionenaustauscherharzen und den geladenen Molekülen zu trennen.

Anwendungen der Anionenaustauschchromatographie

  • Anionenaustauschchromatographie wird verwendet, um Proteine ​​und Aminosäuren aus ihren Gemischen zu trennen.
  • Negativ geladene Nukleinsäuren können abgetrennt werden, was bei der weiteren Analyse der Nukleinsäuren hilft.
  • Dieses Verfahren kann auch zur Wasserreinigung verwendet werden, bei der die Anionen gegen Hydroxylionen ausgetauscht werden.
  • Anionenaustauscherharze können zur Abtrennung von Metallen verwendet werden, da sie meist negativ geladene Komplexe aufweisen, die an die Anionenaustauscher gebunden sind.

Beispiele für Anionenaustauschchromatographie

  • Die Abtrennung von Nukleinsäuren aus einem nach Zellzerstörung erhaltenen Gemisch.
  • Die Abtrennung von Proteinen aus dem aus dem Blutserum gewonnenen Rohgemisch.

3. Kationenaustauschchromatographie

Anionenaustauschchromatographie ist die Trenntechnik für positiv geladene Moleküle durch deren Wechselwirkung mit der negativ geladenen stationären Phase in Form von Ionenaustauscherharz.

Prinzip der Kationenaustauschchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Anziehungsprinzip von negativ geladenem Harz und dem positiv geladenen Analyten. Hier findet der Austausch von negativ geladenen Ionen statt, um die positiv geladenen Moleküle zu entfernen.
  • Die stationäre Phase wird zuerst mit negativen Ladungen beschichtet, wo die Komponenten der Mischung mit positiven Ladungen binden.
  • Ein Kationenaustauscherharz mit einer höheren Affinität zu den positiv geladenen Komponenten bindet dann die Komponenten und verdrängt das negativ geladene Harz.
  • Der Kationenaustauscherharz-Komponenten-Komplex wird dann unter Verwendung verschiedener Puffer entfernt.

Schritte der Kationenaustauschchromatographie

  • Als stationäre Phase wird eine mit negativ geladenem Harz gefüllte Säule verwendet.
  • Die Mischung mit den geladenen Partikeln wird dann die Säule entlang geleitet, wo die positiv geladenen Moleküle an die negativ geladenen Harze binden.
  • Das Kationenaustauscherharz wird dann durch die Säule geleitet, wo sich die positiv geladenen Moleküle nun an das Kationenaustauscherharz binden und das negativ geladene Harz verdrängen.
  • Nun wird ein geeigneter Puffer auf die Säule aufgetragen, um den Komplex aus Kationenaustauscherharzen und den geladenen Molekülen zu trennen.

Anwendungen der Kationenaustauschchromatographie

  • Die Kationenaustauschchromatographie wird zur Analyse der nach der Hydrolyse von Nukleinsäuren erhaltenen Produkte verwendet.
  • Dies kann auch für die Trennung von Metallen verwendet werden, bei denen die Metallionen selbst an die negativ geladenen Harze binden, um die negativ geladenen Komplexe zu entfernen.
  • Die Kationenaustauschchromatographie hilft bei der Reinigung von Wasser, indem das positiv geladene Ion durch die Wasserstoffionen ausgetauscht wird.
  • Es wird auch verwendet, um die Gesteine ​​und andere anorganische Moleküle zu analysieren.

Beispiele für Kationenaustauschchromatographie

  • Die Abtrennung von positiv geladenen Lanthanoid-Ionen aus der Erdkruste.
  • Die Bestimmung der gesamten gelösten Salze in natürlichen Wässern durch Analyse des Vorhandenseins von Calciumionen.

4. Säulenchromatographie

Säulenchromatographie ist die Trenntechnik, bei der die Komponenten in einem Gemisch auf der Grundlage ihrer differentiellen Adsorption mit der stationären Phase getrennt werden, was dazu führt, dass sie sich beim Durchgang durch eine Säule mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen.

Es ist eine Fest-Flüssig-Chromatographie-Technik, bei der die stationäre Phase ein Feststoff und die mobile Phase eine Flüssigkeit oder ein Gas ist.

Prinzip der Säulenchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der differentiellen Adsorption, bei der verschiedene Moleküle in einer Mischung unterschiedliche Affinitäten mit dem auf der stationären Phase vorhandenen Absorptionsmittel aufweisen.
  • Die Moleküle mit höherer Affinität bleiben für längere Zeit adsorbiert, wodurch ihre Bewegungsgeschwindigkeit durch die Säule verringert wird.
  • Die Moleküle mit geringerer Affinität bewegen sich jedoch mit einer schnelleren Bewegung, wodurch die Moleküle in verschiedene Fraktionen getrennt werden können.
  • Dabei ist die stationäre Phase in der Säulenchromatographie auch als Absorptionsmittel bezeichnet, ein Feststoff (meist Kieselsäure) und die mobile Phase eine Flüssigkeit, die den Molekülen einen reibungslosen Durchgang durch die Säule ermöglicht.

Schritte der Säulenchromatographie

  • Zur Vorbereitung der Säule wird ein Glasröhrchen entnommen, das getrocknet und mit einer dünnen, gleichmäßigen Schicht stationärer Phase (Cellulose, Kieselsäure) beschichtet wird.
  • Anschließend wird die Probe durch Zugabe der Mischung zur mobilen Phase vorbereitet. Die Probe wird von oben in die Säule eingeführt und lässt die Probe unter dem Einfluss der Schwerkraft passieren.
  • Die an die Säule gebundenen Moleküle werden durch eine Elutionstechnik getrennt, wobei entweder eine Lösung gleicher Polarität verwendet wird (isokratische Technik) oder unterschiedliche Proben mit unterschiedlichen Polaritäten verwendet werden (Gradiententechnik).
  • Die getrennten Moleküle können für verschiedene Zwecke weiter analysiert werden.

Anwendungen der Säulenchromatographie

  • Säulenchromatographie wird routinemäßig zur Abtrennung von Verunreinigungen und zur Reinigung verschiedener biologischer Gemische verwendet.
  • Diese Technik kann auch zur Isolierung von aktiven Molekülen und Metaboliten aus verschiedenen Proben verwendet werden.
  • Die Säulenchromatographie wird zunehmend zum Nachweis von Drogen in Rohextrakten eingesetzt.

Beispiele für Säulenchromatographie

  • Extraktion von Pestiziden aus festen Lebensmittelproben tierischen Ursprungs, die Lipide, Wachse und Pigmente enthalten.
  • Synthese von Pramlintide, einem Analogon von Amylin, einem Peptidhormon, zur Behandlung von Typ-1- und Typ-2-Diabetikern .
  • Reinigung von bioaktiven Glykolipiden, die antivirale Aktivität gegenüber HSV-1 (Herpesvirus) zeigen.

5. Flash-Chromatographie

Flash-Chromatographie ist eine Trenntechnik, bei der Gelpartikel kleinerer Größe als stationäre Phase verwendet werden und Druckgas verwendet wird, um das Lösungsmittel durch die Säule zu treiben.

Prinzip der Flash-Chromatographie

  • Das Prinzip der Flash-Chromatographie ähnelt dem der Säulenchromatographie, bei der die Komponenten aufgrund ihrer differentiellen Adsorption an die stationäre Phase getrennt werden.
  • Die aufgetragene Probe wird unter Verwendung eines Druckgases geleitet, wodurch der Prozess schneller und effizienter wird.
  • Moleküle binden aufgrund ihrer Affinität an die stationäre Phase, während der Rest des Lösungsmittels durch Anlegen des Druckgases eluiert wird, was den Prozess beschleunigt.
  • Dabei ist die stationäre Phase fest, die mobile Phase und die Elutionslösung flüssig und es wird ein zusätzliches Druckgas verwendet.

Schritte der Flash-Chromatographie

  • Zur Vorbereitung der Säule wird ein Glasröhrchen entnommen, das getrocknet und mit einer dünnen, gleichmäßigen Schicht stationärer Phase (Cellulose, Kieselsäure) beschichtet wird. Der Boden und der Kopf der Säule sind mit Watte gefüllt, um ein Entweichen des Gels zu verhindern.
  • Anschließend wird die Probe durch Zugabe der Mischung zur mobilen Phase vorbereitet. Die Probe wird von oben in die Säule eingeführt, und eine gepumpte Probe wird verwendet, um die Probe mit konstanter Geschwindigkeit zu passieren.
  • Die an die Säule gebundenen Moleküle werden durch Elutionslösung getrennt, wobei entweder Lösungen gleicher Polarität verwendet werden (isokratische Technik) oder verschiedene Proben mit unterschiedlichen Polaritäten verwendet werden (Gradiententechnik).
  • Das Elutionslösungsmittel wird mit einem konstanten Mindestdruck aufgebracht, der erforderlich ist, um den gelösten Stoff die Säule hinunter zu bewegen.
  • Die getrennten Moleküle können für verschiedene Zwecke weiter analysiert werden.

Anwendungen der Flash-Chromatographie

  • Flash-Chromatographie wird als schnelle und effizientere Methode zur Trennung von Komponenten verschiedener Mischungen verwendet.
  • Es wird zur Entfernung von Verunreinigungen aus Rohextrakten natürlicher und synthetischer Mischungen verwendet.

6. Gaschromatographie

Die Gaschromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die Moleküle aufgrund ihrer Retentionszeit in Abhängigkeit von der Affinität der Moleküle zur stationären Phase getrennt werden.

Die Probe ist entweder flüssig oder gasförmig, das an der Injektionsstelle verdampft wird.

Prinzip der Gaschromatographie

  • Die Gaschromatographie basiert auf dem Prinzip, dass Komponenten mit einer höheren Affinität zur stationären Phase eine höhere Retentionszeit haben, da sie länger brauchen, um aus der Säule zu kommen.
  • Die Komponenten mit einer höheren Affinität zur stationären Phase haben jedoch eine geringere Retentionszeit, wenn sie sich zusammen mit der mobilen Phase bewegen.
  • Die mobile Phase ist ein Gas, meist Helium, das die Probe durch die Säule trägt.
  • Die einmal injizierte Probe wird in die Dampfphase umgewandelt und dann durch einen Detektor geleitet, um die Retentionszeit zu bestimmen.
  • Die Komponenten werden getrennt gesammelt, da sie zu unterschiedlichen Zeitpunkten aus der stationären Phase austreten.

Schritte der Gaschromatographie

  • Die Probe wird in die Säule injiziert, wo sie in einen gasförmigen Zustand verdampft wird. Die verdampfte Komponente vermischt sich dann mit der mobilen Phase, die durch den Rest der Säule getragen wird.
  • Die Säule wird mit der stationären Phase eingestellt, in der die Moleküle aufgrund ihrer Affinität zur stationären Phase getrennt werden.
  • Die Komponenten der Mischung erreichen den Detektor aufgrund unterschiedlicher Verweilzeiten in der Säule zu unterschiedlichen Zeiten.

Anwendungen der Gaschromatographie

  • Diese Technik wird verwendet, um die Konzentration verschiedener Chemikalien in verschiedenen Proben zu berechnen.
  • Dies wird bei der Analyse von Luftschadstoffen, Ölverschmutzungen und anderen Proben verwendet.
  • Gaschromatographie kann auch in der Forensik verwendet werden, um verschiedene biologische Proben, die am Tatort gefunden wurden, zu identifizieren und zu quantifizieren.

Beispiele für Gaschromatographie

  • Der Nachweis von leistungssteigernden Medikamenten im Urin des Sportlers.
  • Die Trennung und Quantifizierung eines festen Arzneimittels in Boden- und Wasserproben.

7. Gelfiltrationschromatographie / Gelpermeationschromatographie / Größenausschlusschromatographie / Molekularsiebchromatographie

Die Gelfiltrationschromatographie ist eine Form der Verteilungschromatographie, die verwendet wird, um Moleküle unterschiedlicher Molekülgrößen zu trennen.

Diese Technik wurde auch häufig mit verschiedenen anderen Namen bezeichnet, einschließlich Gelpermeation, Gelausschluss, Größenausschluss und Molekularsiebchromatographie.

Prinzip

  • Moleküle werden in Abhängigkeit von ihrer relativen Größe zwischen einer mobilen Phase und einer stationären Phase aufgeteilt.
  • Die stationäre Phase ist eine Matrix aus porösem Polymer mit Poren bestimmter Größe.
  • Wenn die Probe mit der mobilen Phase injiziert wird, besetzt die mobile Phase die Poren der stationären Phase.
  • Wenn die Größe der Moleküle ausreichend ist, um in die Poren einzutreten, verbleiben sie teilweise oder vollständig in den Poren.
  • Moleküle mit größerer Größe werden jedoch daran gehindert, in die Poren einzudringen, wodurch sie mit der mobilen Phase aus der Säule herausbewegt werden.
  • Wird die mobile Phase in wässriger Lösung verwendet, wird das Verfahren als Gelfiltrationschromatographie bezeichnet.
  • Wird als mobile Phase ein organisches Lösungsmittel verwendet, spricht man von Gelpermeationschromatographie.

Schritte

  • Die Säule ist mit semipermeablen, porösen Polymergelkügelchen mit einem wohldefinierten Porengrößenbereich gefüllt.
  • Die mit der mobilen Phase vermischte Probe wird dann vom oberen Ende der Säule in die Säule injiziert.
  • Die an die Säule gebundenen Moleküle werden durch Elutionslösung getrennt, wobei entweder Lösungen gleicher Polarität verwendet werden (isokratische Technik) oder verschiedene Proben mit unterschiedlichen Polaritäten verwendet werden (Gradiententechnik).
  • Elutionsbedingungen (pH, essentielle Ionen, Cofaktoren, Protease-Inhibitoren usw.) können ausgewählt werden, die die Anforderungen des interessierenden Moleküls ergänzen.

Verwendet

  • Einer der Hauptvorteile der Gelfiltrationschromatographie besteht darin, dass die Trennung unter Bedingungen durchgeführt werden kann, die speziell entwickelt wurden, um die Stabilität und Aktivität des interessierenden Moleküls aufrechtzuerhalten, ohne die Auflösung zu beeinträchtigen.
  • Das Fehlen eines Molekül-Matrix-Bindungsschritts verhindert auch eine unnötige Beschädigung zerbrechlicher Moleküle und stellt sicher, dass Gelfiltrationstrennungen im Allgemeinen eine hohe Aktivitätsrückgewinnung ergeben.
  • Aufgrund ihres einzigartigen Trennungsmodus wurde die Gelfiltrationschromatographie erfolgreich bei der Reinigung von Proteinen und Peptiden aus verschiedenen Quellen verwendet.
  • Gelfiltrationschromatographie wurde verwendet, um verschiedene Nukleinsäurespezies wie DNA, RNA und tRNA sowie deren konstituierende Basen, Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin und Uracil, zu trennen.

Beispiele

  • Die Trennung von rekombinantem humanen Granulozyten-Kolonie-stimulierenden Faktor (rhG-CSF) von Einschlusskörperchen in hoher Ausbeute durch Harnstoff-Gradienten-Größenausschlusschromatographie.
  • Die Trennung von Hühnerei-Lysozym unter Verwendung von Gelsäulen auf Acrylamid- und Dextranbasis.

8. Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist eine modifizierte Form der Säulenchromatographie, bei der die Komponenten eines Gemisches aufgrund ihrer Affinität zur stationären Phase getrennt werden.

Prinzip der HPLC

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der differentiellen Adsorption, bei der verschiedene Moleküle in einer Mischung unterschiedlich stark mit dem auf der stationären Phase vorhandenen Absorptionsmittel wechselwirken.
  • Die Moleküle mit höherer Affinität bleiben für längere Zeit adsorbiert, wodurch ihre Bewegungsgeschwindigkeit durch die Säule verringert wird.
  • Die Moleküle mit geringerer Affinität bewegen sich jedoch mit einer schnelleren Bewegung, wodurch die Moleküle in verschiedene Fraktionen getrennt werden können.
  • Dieses Verfahren unterscheidet sich geringfügig von der Säulenchromatographie wie in diesem Fall; das Lösungsmittel wird unter hohem Druck von bis zu 400 Atmosphären gezwungen, anstatt es unter der Schwerkraft heruntertropfen zu lassen.

Schritte der HPLC

  • Zur Vorbereitung der Säule wird ein Glasröhrchen entnommen, das getrocknet und mit einer dünnen, gleichmäßigen Schicht stationärer Phase (Cellulose, Kieselsäure) beschichtet wird.
  • Anschließend wird die Probe durch Zugabe der Mischung zur mobilen Phase vorbereitet. Die Probe wird von oben in die Säule eingeführt, und eine Hochdruckpumpe wird verwendet, um die Probe mit konstanter Geschwindigkeit zu passieren.
  • Die mobile Phase bewegt sich dann nach unten zu einem Detektor, der Moleküle bei einer bestimmten Absorptionswellenlänge erkennt.
  • Die getrennten Moleküle können für verschiedene Zwecke weiter analysiert werden.

Anwendungen von HPLC

  • Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wird bei der Analyse von Schadstoffen in Umweltproben verwendet.
  • Es wird durchgeführt, um die Produktreinheit und Qualitätskontrolle verschiedener industrieller Produktionen aufrechtzuerhalten.
  • Diese Technik kann auch verwendet werden, um verschiedene biologische Moleküle wie Proteine ​​und Nukleinsäuren zu trennen.
  • Die erhöhte Geschwindigkeit dieser Technik macht den Prozess schneller und effektiver.

Beispiel für HPLC

  • Hochleistungsflüssigkeitschromatographie wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit verschiedener Antikörper gegen Krankheiten wie Ebola zu testen.

9. Hydrophobe Interaktionschromatographie

Hydrophobe Interaktionschromatographie ist die Trenntechnik, die Moleküle auf der Grundlage ihres Hydrophobiegrads trennt.

Prinzip der hydrophoben Interaktionschromatographie

  • Das Prinzip der hydrophoben Interaktionschromatographie basiert auf der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen mit hydrophoben Gruppen.
  • Hier ist die stationäre Phase ein fester Träger, auf den sowohl hydrophobe als auch hydrophile Gruppen aufgebracht sind.
  • Die hydrophoben Bereiche enthaltenden Lösungsmittelmoleküle wechselwirken mit den hydrophoben Gruppen, wodurch sie von den Molekülen mit hydrophilen Gruppen getrennt werden.
  • Anschließend wird die Wechselwirkung durch Auftragen einer Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten umgekehrt, wodurch die Moleküle mit hydrophoben Gruppen von der stationären Phase getrennt werden.

Schritte der hydrophoben Interaktionschromatographie

  • Die Säule wird mit einem Glasrohr vorbereitet, das mit einem festen Träger wie Kieselgel versehen ist, an dem hydrophobe Gruppen wie Phenyl, Octylbutyl angebracht sind.
  • Die Probenvorbereitung erfolgt durch Zugabe der Mischung zur mobilen Phase.
  • Die Probe wird dann vom oberen Ende der Säule in die Säule injiziert.
  • Die Moleküle mit hydrophoben Gruppen gehen eine Wechselwirkung mit den hydrophoben Gruppen der stationären Phase ein. Im Gegensatz dazu wandern die Moleküle ohne solche Gruppen mit der mobilen Phase aus der Säule.
  • Anschließend wird eine bestimmte Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten in die Säule geleitet, die die gebundenen Moleküle von der stationären Phase entfernt.

Anwendungen der hydrophoben Interaktionschromatographie

  • Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie ist für die Trennung von Proteinen mit hydrophoben Gruppen äußerst wichtig.
  • Diese Technik ist besser geeignet als andere Verfahren, da diese Technik zu minimalen Denaturierungsaktivitäten führt.
  • In ähnlicher Weise kann dieses Verfahren auch auf die Abtrennung anderer organischer Verbindungen mit hydrophoben Gruppen angewendet werden.
  • Dies ermöglicht die Trennung von hydrophilen und hydrophoben biologischen Molekülen voneinander.

Beispiel für Hydrophobe Interaktionschromatographie

  • Die Abtrennung von Pflanzenproteinen aus den Rohextrakten.

10. Ionenaustauschchromatographie

Die Ionenaustauschchromatographie ist die Trenntechnik für geladene Moleküle durch deren Wechselwirkung mit der entgegengesetzt geladenen stationären Phase in Form von Ionenaustauscherharz.

Prinzip der Ionenaustauschchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der Anziehung von geladenem Harz und dem entgegengesetzt geladenen Analyten. Hier findet der Austausch von negativ/positiv geladenen Ionen statt, um die geladenen Moleküle zu entfernen.
  • Die stationäre Phase wird zuerst mit bestimmten Ladungen beschichtet, wo die Komponenten der Mischung mit entgegengesetzten Ladungen binden.
  • Ein Kationen- oder Anionenaustauscherharz mit einer höheren Affinität zu den geladenen Komponenten bindet dann die Komponenten und verdrängt das entgegengesetzt geladene Harz.
  • Der Kationen- oder Anionenaustauscherharz-Komponenten-Komplex wird dann unter Verwendung verschiedener Puffer entfernt.

Schritte der Ionenaustauschchromatographie

  • Als stationäre Phase wird eine Säule verwendet, die mit geladenem Harz gefüllt ist, das entweder positiv oder negativ geladen sein kann.
  • Die Mischung mit den geladenen Partikeln wird dann die Säule entlang geleitet, wo die geladenen Moleküle an die entgegengesetzt geladenen Harze binden.
  • Wenn ein Kationenaustauscherharz verwendet wird, binden die positiv geladenen Moleküle nun an das Kationenaustauscherharz und verdrängen das negativ geladene Harz.
  • Wenn ein Anionenaustauscherharz verwendet wird, binden die negativ geladenen Moleküle ähnlich an das Anionenaustauscherharz und verdrängen das positiv geladene Harz.
  • Nun wird ein entsprechender Puffer auf die Säule aufgetragen, um den Komplex aus geladenen Austauscherharzen und den geladenen Molekülen zu trennen.

Anwendungen der Ionenaustauschchromatographie

  • Die Ionenaustauschchromatographie wird bei der Reinigung von Wasser verwendet, bei der die positiv geladenen Ionen durch Wasserstoffionen und die negativ geladenen Ionen durch Hydroxylionen ersetzt werden.
  • Dieses Verfahren funktioniert auch als effektives Verfahren zur Analyse der nach der Hydrolyse von Nukleinsäuren gebildeten Produkte.
  • Auch die Trennung von Metallen und anderen anorganischen Verbindungen wird durch die Ionenaustauschchromatographie erleichtert.

Beispiele für Ionenaustauschchromatographie

  • Die Abtrennung von positiv geladenen Lanthanoid-Ionen aus der Erdkruste.
  • Die Abtrennung von Proteinen aus dem aus dem Blutserum gewonnenen Rohgemisch.

11. Flüssigkeitschromatographie

Flüssigchromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die mobile Phase flüssig ist und die Trennung entweder in einer Säule oder auf einer glatten Oberfläche erfolgen kann.

Prinzip der Flüssigkeitschromatographie

  • Das Verfahren der Flüssigkeitschromatographie basiert auf dem Prinzip der Affinität der Moleküle zur mobilen Phase.
  • Wenn die zu trennenden Komponenten eine höhere Affinität zur mobilen Phase aufweisen, bewegen sich die Moleküle mit der mobilen Phase und kommen schneller aus der Säule.
  • Haben die Komponenten jedoch eine geringere Wechselwirkung mit der mobilen Phase, bewegen sich die Moleküle langsam und kommen so später aus der Säule.
  • Wenn also zwei Moleküle in einer Mischung unterschiedliche Polaritäten aufweisen und die mobile Phase eine unterschiedliche Polarität aufweist, bewegen sich die beiden Moleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die stationäre Phase.

Schritte der Flüssigkeitschromatographie

  • Die Säule oder das Papier wird hergestellt, indem die stationäre Phase (Zellulose oder Kieselsäure) auf den festen Träger aufgebracht wird.
  • Die Probe wird der flüssigen mobilen Phase zugesetzt, die dann in das Chromatographiesystem injiziert wird.
  • Die mobile Phase durchläuft die stationäre Phase, bevor sie aus der Säule oder dem Papierrand austritt.
  • Eine Elutionslösung wird auf das System aufgebracht, um die Moleküle von der stationären Phase zu trennen.

Anwendungen der Flüssigkeitschromatographie

  • Die Flüssigkeitschromatographie ist eine effektive Methode zur Trennung einer farbigen Lösung, da sie nach der Trennung zwei separate Banden bilden.
  • Diese Methode kann auch gegenüber anderen Techniken verwendet werden, da sie recht einfach und kostengünstiger ist.
  • Es kann zur Trennung von wasserunlöslichen Feststoffmolekülen verwendet werden.

Beispiele für Flüssigkeitschromatographie

  • Die Hochleistungsflüssigkeitschromatographie ist eine modifizierte Form der Flüssigkeitschromatographie, die in der Erforschung biologischer Moleküle verwendet wird.

12. Papierchromatographie

Die Papierchromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die Trennung auf einem speziellen Papier durchgeführt wird.

Prinzip der Papierchromatographie

  • Es gibt zwei Arten der Papierchromatographie, die auf zwei verschiedenen Prinzipien basieren.
  • Die erste ist die Papieradsorptionschromatographie, die auf der unterschiedlichen Wechselwirkung zwischen den Molekülen und der stationären Phase beruht.
  • Die Moleküle mit höherer Affinität bleiben für längere Zeit adsorbiert, wodurch ihre Bewegungsgeschwindigkeit durch die Säule verringert wird.
  • Die Moleküle mit geringerer Affinität bewegen sich jedoch mit einer schnelleren Bewegung, wodurch die Moleküle in verschiedene Fraktionen getrennt werden können.
  • Die zweite Art der Papierchromatographie ist die Papierverteilungschromatographie. Es basiert auf dem Prinzip, dass die Feuchtigkeit auf dem Zellstoffpapier als stationäre Phase für die mit der mobilen Phase bewegten Moleküle fungiert.
  • Die Trennung der Moleküle basiert also darauf, wie stark sie an der stationären Phase adsorbieren.
  • Ein zusätzliches Konzept des „Retentionsfaktors“ wird bei der Trennung von Molekülen in der Papierchromatographie angewendet.
  • Der Retentionswert für ein Molekül wird als Verhältnis der zurückgelegten Strecke des Moleküls zur zurückgelegten Strecke der mobilen Phase bestimmt.
  • Der Retentionswert verschiedener Moleküle kann verwendet werden, um diese Moleküle zu unterscheiden.

Schritte der Papierchromatographie

  • Die stationäre Phase wird als Zellulosepapier von feiner Qualität ausgewählt.
  • Als mobile Phase werden verschiedene Kombinationen von organischen und anorganischen Lösungsmitteln verwendet.
  • Etwa 2-200 µl der Probenlösung werden an der Grundlinie des Papiers injiziert und es wird an der Luft trocknen gelassen.
  • Das mit der Probe beladene Papier wird dann vorsichtig in die mobile Phase bis zu einer Höhe von 1 cm eingetaucht.
  • Nachdem die mobile Phase den Rand des Papiers erreicht hat, wird das Papier herausgenommen.
  • Der Retentionsfaktor wird berechnet und die getrennten Komponenten werden mit verschiedenen Techniken nachgewiesen.

Anwendungen der Papierchromatographie

  • Die Papierchromatographie wird durchgeführt, um die Reinheit verschiedener pharmazeutischer Produkte nachzuweisen.
  • Es kann auch zum Nachweis von Kontaminationen in verschiedenen Proben wie Lebensmitteln und Getränken eingesetzt werden.
  • Dieses Verfahren kann auch zur Abtrennung von Verunreinigungen aus verschiedenen Industrieprodukten verwendet werden.
  • Die Analyse der Reaktionsmischungen in chemischen Labors erfolgt ebenfalls über Papierchromatographie.

Beispiele für Papierchromatographie

  • Die Papierchromatographie wird bei der Trennung von Tintengemischen oder anderen farbigen Getränken verwendet.

13. Umkehrphasenchromatographie

Die Umkehrphasenchromatographie ist eine Flüssigchromatographietechnik, bei der die Trennung von Molekülen durch hydrophobe Wechselwirkung zwischen der flüssigen mobilen Phase und der stationären Phase erreicht wird.

Prinzip der Umkehrphasenchromatographie

  • Das Prinzip der Umkehrphasenchromatographie basiert auf der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen mit hydrophoben Gruppen.
  • Hier ist die stationäre Phase ein fester Träger, auf den sowohl hydrophobe als auch hydrophile Gruppen aufgebracht sind.
  • Die hydrophoben Bereiche enthaltenden Lösungsmittelmoleküle wechselwirken mit den hydrophoben Gruppen, wodurch sie von den Molekülen mit hydrophilen Gruppen getrennt werden.
  • Anschließend wird die Wechselwirkung durch Auftragen einer Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten umgekehrt, wodurch die Moleküle mit hydrophoben Gruppen von der stationären Phase getrennt werden.

Schritte der Umkehrphasenchromatographie

  • Die Säule wird mit einem Glasrohr vorbereitet, das mit einem festen Träger wie Kieselgel versehen ist, an dem hydrophobe Gruppen wie Phenyl, Octylbutyl angebracht sind.
  • Die Probenvorbereitung erfolgt durch Zugabe der Mischung zur mobilen Phase aus organischen und anorganischen Lösungsmitteln.
  • Die Probe wird dann vom oberen Ende der Säule in die Säule injiziert.
  • Die Moleküle mit hydrophoben Gruppen gehen eine Wechselwirkung mit den hydrophoben Gruppen der stationären Phase ein. Im Gegensatz dazu wandern die Moleküle ohne solche Gruppen mit der mobilen Phase aus der Säule.
  • Anschließend wird eine bestimmte Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten in die Säule geleitet, die die gebundenen Moleküle von der stationären Phase entfernt.

Anwendungen der Umkehrphasenchromatographie

  • Zur Trennung von Biomolekülen wird zunehmend die reverse Chromatographie in Kombination mit der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie eingesetzt.
  • Dies wird auch bei der Untersuchung der Analyse von Medikamenten, Metaboliten und aktiven Molekülen verwendet.
  • Es kann auch verwendet werden, um Verunreinigungen aus verschiedenen Umweltproben zu entfernen.

Beispiele für Umkehrphasenchromatographie

  • Hydrophobe Interaktionschromatographie ist ein Beispiel für Umkehrphasenchromatographie, bei der diese Technik verwendet wird, um Proteine ​​aus ihren Mischungen zu trennen.

14. Dünnschichtchromatographie (DC)

Die Dünnschichtchromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die stationäre Phase als dünne Schicht auf eine feste Trägerplatte mit einer flüssigen mobilen Phase aufgetragen wird.

Prinzip der Dünnschichtchromatographie (DC)

  • Diese Chromatographietechnik basiert auf dem Prinzip, dass Komponenten einer Mischung getrennt werden, wenn die Komponente mit einer Affinität zur stationären Phase an die stationäre Phase bindet. Im Gegensatz dazu werden andere Komponenten mit der mobilen Phase eluiert.
  • Das Substrat/Ligand wird an die stationäre Phase gebunden, so dass die reaktiven Stellen für die Bindung von Komponenten freigelegt werden.
  • Nun wird die Mischung durch die mobile Phase geleitet, wo die Komponenten mit Bindungsstellen für das Substrat an das Substrat auf der stationären Phase binden, während die restlichen Komponenten mit der mobilen Phase eluiert werden.
  • Nach der Trennung sind die Moleküle als Flecken an einer anderen Stelle in der gesamten stationären Phase zu sehen.
  • Der Nachweis von Molekülen erfolgt durch verschiedene Techniken.

Schritte der Dünnschichtchromatographie (DC)

  • Die stationäre Phase wird gleichmäßig auf den festen Träger (Glas, dünne Platte oder Aluminiumfolie) aufgetragen und getrocknet.
  • Die Probe wird als Spots auf die stationäre Phase ca. 1 cm über dem Plattenrand injiziert.
  • Die mit Proben beladene Platte wird dann vorsichtig bis zu einer Höhe von 1 cm in die mobile Phase eingetaucht.
  • Nachdem die mobile Phase den Rand der Platte erreicht hat, wird die Platte herausgenommen.
  • Der Retentionsfaktor wird wie bei der Papierchromatographie berechnet und die getrennten Komponenten werden mit verschiedenen Techniken nachgewiesen.

Anwendungen der Dünnschichtchromatographie (DC)

  • Die Dünnschichtchromatographie wird routinemäßig in Laboratorien durchgeführt, um verschiedene in einem Gemisch vorhandene Substanzen zu identifizieren.
  • Diese Technik hilft bei der Analyse von Fasern in der Forensik.
  • TLC ermöglicht auch die Untersuchung verschiedener pharmazeutischer Produkte.
  • Es hilft bei der Identifizierung von Heilpflanzen und ihrer Zusammensetzung.

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Arten der Chromatographie (Definition, Prinzip, Schritte, Verwendungen)

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