Chromatographie Definition, 13 Arten der Chromatographie, Prinzip, Schritte, Verwendungen)

Chromatographie Definition, 13 Arten der Chromatographie, Prinzip, Schritte, Verwendungen)
Chromatographie Definition, 13 Arten der Chromatographie, Prinzip, Schritte, Verwendungen)

Chromatographie Definition

Die Chromatographie ist eine wichtige biophysikalische Technik, die die Trennung, Identifizierung und Reinigung der Komponenten eines Gemisches für die qualitative und quantitative Analyse ermöglicht.

  • Eine breite Palette von chromatographischen Verfahren nutzt Unterschiede in Größe, Bindungsaffinitäten, Ladung und anderen Eigenschaften, um Materialien zu trennen.
  • Es ist ein leistungsstarkes Trennwerkzeug, das in allen Bereichen der Wissenschaft eingesetzt wird und häufig das einzige Mittel ist, um Komponenten von komplexen Gemischen zu trennen.
  • Die Chromatographie ist eine sehr nützliche Technik, da sie die Trennung von Komponenten eines Gemisches aufgrund ihrer Art, Struktur, Größe und anderer Eigenschaften ermöglicht.
  • Die Chromatographie basiert im Allgemeinen auf dem Prinzip, dass Komponenten eines Gemisches getrennt werden, wenn das zu einer mobilen Phase hinzugefügte Gemisch durch eine stationäre Phase (die meist eine feste Oberfläche ist) bewegt wird, was dazu führt, dass einige Komponenten des Gemisches anhaften die stationäre Phase. Gleichzeitig wird der Rest zusammen mit der mobilen Phase weitergegeben.
  • Somit gibt es zwei wesentliche Komponenten aller Chromatographietechniken.

Was ist eine stationäre Phase?

Die stationäre Phase in der Chromatographie ist die Phase, die entweder ein festes oder flüssiges Teilchen ist, das an ein Glas oder eine Metalloberfläche gebunden ist, auf der die Komponenten der zu trennenden Mischung selektiv absorbiert werden.

  • Der Begriff stationär bezieht sich auf die Tatsache, dass diese Phase stationär bleibt, während sich die andere Phase bewegt.
  • Die meisten als stationäre Phasen verwendeten Substanzen sind porös und ermöglichen so die Anlagerung von Komponenten während der Chromatographie.
  • Die für einen chromatographischen Prozess zu wählende stationäre Phase hängt von der Art der zu trennenden Komponenten und der Art der Chromatographie ab.
  • Abhängig von der Art der Chromatographie-Gelkügelchen werden dünnes, gleichmäßiges Papier, Siliciumdioxid, Glas, einige Gase oder sogar flüssige Komponenten als stationäre Phase verwendet.

Was ist die mobile Phase?

Die mobile Phase in der Chromatographie ist die Phase, die entweder flüssig oder gasförmig ist und durch ein Chromatographiesystem geleitet wird, wobei die Komponenten des Gemisches bei verschiedenen Bewertern durch Adsorption an die stationäre Phase getrennt werden.

  • Die mobile Phase ist das Lösungsmittel, das das Gemisch trägt, wenn es sich durch die stationäre Phase bewegt.
  • Der Begriff mobil zeigt an, dass sich die Phase im chromatographischen System nach unten bewegt, während die andere Phase stationär bleibt.
  • Als mobile Phasen verwendete Substanzen werden für einen chromatographischen Prozess in Abhängigkeit von der Art der zu trennenden Komponenten und der Art der Chromatographie ausgewählt.
  • Alkohol, Wasser, Essigsäure, Aceton oder einige Gase sind die häufig verwendete mobile Phase in verschiedenen chromatographischen Techniken.

Arten der Chromatographie

Affinitätschromatographie

Die Affinitätschromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die Komponenten eines Gemisches aufgrund ihrer Affinität zur stationären Phase des Systems getrennt werden.

Prinzip der Affinitätschromatographie

  • Diese Chromatographietechnik basiert auf dem Prinzip, dass Komponenten eines Gemisches getrennt werden, wenn das Element mit einer Affinität zur stationären Phase an die stationäre Phase bindet. Im Gegensatz dazu werden andere Komponenten mit der mobilen Phase eluiert.
  • Das Substrat / Ligand ist an die stationäre Phase gebunden, so dass die reaktiven Stellen für die Bindung von Komponenten freigelegt werden.
  • Nun wird die Mischung durch die mobile Phase geleitet, wo die Komponenten mit Bindungsstellen für das Substrat an das Substrat in der stationären Phase binden, während der Rest der Komponenten mit der mobilen Phase eluiert wird.
  • Die an die stationäre Phase gebundenen Komponenten werden dann durch Ändern des pH-Werts, der Ionenstärke oder anderer Bedingungen eluiert.

Schritte der Affinitätschromatographie

  • Die Säule wird hergestellt, indem sie mit einem festen Träger wie Agarose oder Cellulose beladen wird, an dem das Substrat / der Ligand mit dem Abstandshalterarm befestigt ist.
  • Die die Mischung enthaltende mobile Phase wird mit konstanter Geschwindigkeit in die Säule gegossen.
  • Sobald der Prozess abgeschlossen ist, wird der Ligand-Molekül-Komplex aus der stationären Phase eluiert, indem die Bedingungen geändert werden, die die Trennung von Ligand und Komponenten des Gemisches begünstigen.

Verwendung der Affinitätschromatographie

  • Die Affinitätschromatographie wird als Stapeltechnik von Enzymen und anderen Proteinen verwendet.
  • Dieses Prinzip wird auch bei In-vitro-Antigen-Antikörper-Reaktionen angewendet.
  • Diese Technik wird zur Trennung von Komponenten sowie zur Entfernung von Verunreinigungen aus einer Mischung verwendet.
  • Die Affinitätschromatographie kann zum Nachweis von Mutationen und Nukleotidpolymorphismen in Nukleinsäuren verwendet werden.

Beispiele für Affinitätschromatographie

  • Die Reinigung von coli-β-Galactosidase aus einer Mischung von Proteinen unter Verwendung der p-Aminophenyl-1-thio-β-D-galactopyranosyl-Agarose als Affinitätsmatrix.
  • Die Entfernung von überschüssigem Albumin und α 2 -Makroglobulin aus dem Serumalbumin.

Anionenaustauschchromatographie

Die Anionenaustauschchromatographie ist die Trenntechnik für negativ geladene Moleküle durch ihre Wechselwirkung mit der positiv geladenen stationären Phase in Form eines Ionenaustauscherharzes.

Prinzip der Anionenaustauschchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der Anziehung von positiv geladenem Harz und des negativ geladenen Analyten. Hier findet der Austausch positiv geladener Ionen statt, um die negativ geladenen Moleküle zu entfernen.
  • Die stationäre Phase wird zuerst mit positiven Ladungen beschichtet, wobei sich die Komponenten der Mischung mit negativen Ladungen binden.
  • Ein Anionenaustauscherharz mit einer höheren Affinität zu den negativ geladenen Komponenten bindet dann die Komponenten und verdrängt das positiv geladene Harz.
  • Der Anionenaustauscherharz-Komponenten-Komplex wird dann unter Verwendung verschiedener Puffer entfernt.

Schritte der Anionenaustauschchromatographie

  • Eine mit positiv geladenem Harz gepackte Säule wird als stationäre Phase genommen.
  • Die Mischung mit den geladenen Teilchen wird dann durch die Säule geleitet, wo die negativ geladenen Moleküle an die positiv geladenen Harze binden.
  • Das Anionenaustauscherharz wird dann durch die Säule geleitet, wo die negativ geladenen Moleküle nun an das Anionenaustauscherharz binden und das positiv geladene Harz verdrängen.
  • Nun wird ein geeigneter Puffer auf die Säule aufgebracht, um den Komplex der Anionenaustauscherharze und der geladenen Moleküle zu trennen.

Verwendung der Anionenaustauschchromatographie

  • Anionenaustauschchromatographie wird verwendet, um Proteine ​​und Aminosäuren von ihren Gemischen zu trennen.
  • Negativ geladene Nukleinsäuren können abgetrennt werden, was bei der weiteren Analyse der Nukleinsäuren hilft.
  • Dieses Verfahren kann auch zur Wasserreinigung verwendet werden, bei der die Anionen gegen Hydroxylionen ausgetauscht werden.
  • Anionenaustauscherharze können zur Trennung von Metallen verwendet werden, da sie üblicherweise negativ geladene Komplexe aufweisen, die an die Anionenaustauscher gebunden sind.

Beispiele für Anionenaustauschchromatographie

  • Die Trennung von Nukleinsäuren aus einer nach Zellzerstörung erhaltenen Mischung.
  • Die Trennung von Proteinen aus der aus dem Blutserum erhaltenen Rohmischung.

Kationenaustauschchromatographie

Die Anionenaustauschchromatographie ist die Trenntechnik für positiv geladene Moleküle durch ihre Wechselwirkung mit einer negativ geladenen stationären Phase in Form eines Ionenaustauscherharzes.

Prinzip der Kationenaustauschchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der Anziehung von negativ geladenem Harz und des positiv geladenen Analyten. Hier findet der Austausch negativ geladener Ionen statt, um die positiv geladenen Moleküle zu entfernen.
  • Die stationäre Phase wird zuerst mit negativen Ladungen beschichtet, wobei sich die Komponenten der Mischung mit positiven Ladungen binden.
  • Ein Kationenaustauscherharz mit einer höheren Affinität zu den positiv geladenen Komponenten bindet dann die Komponenten und verdrängt das negativ geladene Harz.
  • Der Kationenaustauscherharz-Komponenten-Komplex wird dann unter Verwendung verschiedener Puffer entfernt.

Schritte der Kationenaustauschchromatographie

  • Eine mit negativ geladenem Harz gepackte Säule wird als stationäre Phase genommen.
  • Die Mischung mit den geladenen Teilchen wird dann durch die Säule geleitet, wo die positiv geladenen Moleküle an die negativ geladenen Harze binden.
  • Das Kationenaustauscherharz wird dann durch die Säule geleitet, wo die positiv geladenen Moleküle nun an das Kationenaustauscherharz binden und das negativ geladene Harz verdrängen.
  • Nun wird ein geeigneter Puffer auf die Säule aufgebracht, um den Komplex der Kationenaustauscherharze und die geladenen Moleküle zu trennen.

Verwendung der Kationenaustauschchromatographie

  • Die Kationenaustauschchromatographie wird zur Analyse der Produkte verwendet, die nach der Hydrolyse von Nukleinsäuren erhalten werden.
  • Dies kann auch zur Trennung von Metallen verwendet werden, bei denen die Metallionen selbst an die negativ geladenen Harze binden, um die negativ geladenen Komplexe zu entfernen.
  • Die Kationenaustauschchromatographie hilft bei der Reinigung von Wasser, indem sie das positiv geladene Ion durch die Wasserstoffionen austauscht.
  • Es wird auch verwendet, um die Gesteine ​​und andere anorganische Moleküle zu analysieren.

Beispiele für die Kationenaustauschchromatographie

  • Die Trennung positiv geladener Lanthanoidionen aus der Erdkruste.
  • Die Bestimmung der insgesamt in natürlichen Gewässern gelösten Salze durch Analyse des Vorhandenseins von Calciumionen.

Säulenchromatographie

Die Säulenchromatographie ist die Trenntechnik, bei der die Komponenten in einem Gemisch aufgrund ihrer unterschiedlichen Adsorption an die stationäre Phase getrennt werden, was dazu führt, dass sie sich beim Durchgang durch eine Säule mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten bewegen.

Es ist eine Fest-Flüssig-Chromatographie-Technik, bei der die stationäre Phase eine feste und die mobile Phase eine Flüssigkeit oder ein Gas ist.

Prinzip der Säulenchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der differentiellen Adsorption, bei der verschiedene Moleküle in einem Gemisch unterschiedliche Affinitäten zu dem in der stationären Phase vorhandenen Absorptionsmittel aufweisen.
  • Die Moleküle mit höherer Affinität bleiben länger adsorbiert, wodurch ihre Bewegungsgeschwindigkeit durch die Säule verringert wird.
  • Die Moleküle mit geringerer Affinität bewegen sich jedoch mit einer schnelleren Bewegung, wodurch die Moleküle in verschiedenen Fraktionen getrennt werden können.
  • Hier ist die stationäre Phase in der Säulenchromatographie, die auch als Absorptionsmittel bezeichnet wird, ein Feststoff (meistens Siliciumdioxid) und die mobile Phase ist eine Flüssigkeit, die es den Molekülen ermöglicht, sich reibungslos durch die Säule zu bewegen.

Schritte der Säulenchromatographie

  • Die Säule wird hergestellt, indem ein Glasrohr genommen wird, das getrocknet und mit einer dünnen, gleichmäßigen Schicht stationärer Phase (Cellulose, Siliciumdioxid) beschichtet wird.
  • Dann wird die Probe hergestellt, indem die Mischung der mobilen Phase zugesetzt wird. Die Probe wird von oben in die Säule eingeführt und kann die Probe unter dem Einfluss der Schwerkraft passieren.
  • Die an die Säule gebundenen Moleküle werden durch Elutionstechnik getrennt, wobei entweder eine Lösung gleicher Polarität verwendet wird (isokratische Technik) oder unterschiedliche Proben mit unterschiedlichen Polaritäten verwendet werden (Gradiententechnik).
  • Die abgetrennten Moleküle können für verschiedene Zwecke weiter analysiert werden.

Verwendung der Säulenchromatographie

  • Die Säulenchromatographie wird routinemäßig zur Abtrennung von Verunreinigungen und zur Reinigung verschiedener biologischer Gemische eingesetzt.
  • Diese Technik kann auch zur Isolierung von aktiven Molekülen und Metaboliten aus verschiedenen Proben verwendet werden.
  • Die Säulenchromatographie wird zunehmend zum Nachweis von Arzneimitteln in Rohextrakten eingesetzt.

Beispiele für Säulenchromatographie

  • Extraktion von Pestiziden aus festen Lebensmittelproben tierischen Ursprungs, die Lipide, Wachse und Pigmente enthalten.
  • Synthese von Pramlintid, einem Analogon von Amylin, einem Peptidhormon, zur Behandlung von Typ 1 und Typ 2 Diabetikern .
  • Reinigung von bioaktiven Glykolipiden, die eine antivirale Aktivität gegenüber HSV-1 (Herpesvirus) zeigen.

Flash-ChromatographieDie Flash-Chromatographie ist eine Trenntechnik, bei der kleinere Größen von Gelpartikeln als stationäre Phase verwendet werden und unter Druck stehendes Gas verwendet wird, um das Lösungsmittel durch die Säule zu treiben.

Prinzip der Flash-Chromatographie

  • Das Prinzip der Flash-Chromatographie ähnelt dem der Säulenchromatographie, bei der die Komponenten aufgrund ihrer differentiellen Adsorption an die stationäre Phase getrennt werden.
  • Die aufgebrachte Probe wird unter Verwendung eines Druckgases geleitet, das den Prozess schneller und effizienter macht.
  • Moleküle binden aufgrund ihrer Affinität an die stationäre Phase, während der Rest des Lösungsmittels durch Aufbringen des Druckgases, das den Prozess beschleunigt, eluiert wird.
  • Hier ist die stationäre Phase fest, die mobile Phase und die Elutionslösung sind flüssig und es wird ein zusätzliches Druckgas verwendet.

Schritte der Flash-Chromatographie

  • Die Säule wird hergestellt, indem ein Glasrohr genommen wird, das getrocknet und mit einer dünnen, gleichmäßigen Schicht stationärer Phase (Cellulose, Siliciumdioxid) beschichtet wird. Der Boden und der Kopf der Säule sind mit Watte gefüllt, um ein Entweichen des Gels zu verhindern.
  • Dann wird die Probe hergestellt, indem die Mischung der mobilen Phase zugesetzt wird. Die Probe wird von oben in die Säule eingeführt, und eine gepumpte Probe wird verwendet, um die Probe mit einer konstanten Geschwindigkeit zu passieren.
  • Die an die Säule gebundenen Moleküle werden durch Elutionslösung getrennt, wobei entweder eine Lösung gleicher Polarität verwendet wird (isokratische Technik) oder unterschiedliche Proben mit unterschiedlichen Polaritäten verwendet werden (Gradiententechnik).
  • Das Elutionslösungsmittel wird mit einem konstanten Mindestdruck aufgebracht, der erforderlich ist, um den gelösten Stoff die Säule hinunter zu bewegen.
  • Die abgetrennten Moleküle können für verschiedene Zwecke weiter analysiert werden.

Verwendung der Flash-Chromatographie

  • Die Flash-Chromatographie wird als schnelle und effizientere Methode zur Trennung von Komponenten verschiedener Gemische verwendet.
  • Es dient zur Entfernung von Verunreinigungen aus Rohextrakten natürlicher und synthetischer Gemische.

Gaschromatographie

Die Gaschromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die Moleküle aufgrund ihrer Retentionszeit in Abhängigkeit von der Affinität der Moleküle zur stationären Phase getrennt werden.

Die Probe ist entweder flüssig oder gasförmig und wird am Injektionspunkt verdampft.

Prinzip der Gaschromatographie

  • Die Gaschromatographie basiert auf dem Prinzip, dass Komponenten mit einer höheren Affinität zur stationären Phase eine höhere Retentionszeit haben, da sie länger brauchen, um aus der Säule herauszukommen.
  • Die Komponenten mit einer höheren Affinität zur stationären Phase haben jedoch eine geringere Retentionszeit, wenn sie sich zusammen mit der mobilen Phase bewegen.
  • Die mobile Phase ist ein Gas, meistens Helium, das die Probe durch die Säule transportiert.
  • Die einmal in die Dampfstufe umgewandelte Probe wird dann durch einen Detektor geleitet, um die Retentionszeit zu bestimmen.
  • Die Komponenten werden separat gesammelt, wenn sie zu unterschiedlichen Zeiten aus der stationären Phase kommen.

Schritte der Gaschromatographie

  • Die Probe wird in die Säule injiziert, wo sie in einen gasförmigen Zustand verdampft wird. Die verdampfte Komponente mischt sich dann mit der mobilen Phase, die durch den Rest der Säule getragen werden soll.
  • Die Säule ist auf die stationäre Phase eingestellt, in der die Moleküle aufgrund ihrer Affinität zur stationären Phase getrennt sind.
  • Die Komponenten der Mischung erreichen den Detektor zu unterschiedlichen Zeiten aufgrund von Unterschieden in der Zeit, in der sie in der Säule zurückgehalten werden.

Verwendung der Gaschromatographie

  • Diese Technik wird verwendet, um die Konzentration verschiedener Chemikalien in verschiedenen Proben zu berechnen.
  • Dies wird bei der Analyse von Luftschadstoffen, Ölverschmutzungen und anderen Proben verwendet.
  • Die Gaschromatographie kann auch in der Forensik eingesetzt werden, um verschiedene am Tatort gefundene biologische Proben zu identifizieren und zu quantifizieren.

Beispiele für Gaschromatographie

  • Die Identifizierung eines leistungsinduzierenden Arzneimittels im Urin des Athleten.
  • Die Trennung und Quantifizierung eines festen Arzneimittels in Boden- und Wasserproben.

Gelfiltrationschromatographie / Gelpermeationschromatographie / Größenausschlusschromatographie / Molekularsiebchromatographie

Die Gelfiltrationschromatographie ist eine Form der Partitionschromatographie, mit der Moleküle unterschiedlicher Molekülgröße getrennt werden.

Diese Technik wurde auch häufig mit verschiedenen anderen Namen bezeichnet, einschließlich Gelpermeation, Gelausschluss, Größenausschluss und Molekularsiebchromatographie.

Prinzip

  • Moleküle werden in Abhängigkeit von ihrer relativen Größe zwischen einer mobilen Phase und einer stationären Phase aufgeteilt.
  • Die stationäre Phase ist eine Matrix aus porösem Polymer, die Poren spezifischer Größe aufweist.
  • Wenn der Probe die mobile Phase injiziert wird, nimmt die mobile Phase die Poren der stationären Phase ein.
  • Wenn die Größe der Moleküle ausreicht, um in die Poren einzudringen, verbleiben sie teilweise oder vollständig in den Poren.
  • Moleküle mit einer größeren Größe werden jedoch daran gehindert, in die Poren einzutreten, was dazu führt, dass sie mit der mobilen Phase aus der Säule herausbewegt werden.
  • Wenn die mobile Phase in einer wässrigen Lösung verwendet wird, wird das Verfahren als Gelfiltrationschromatographie bezeichnet.
  • Wenn die verwendete mobile Phase ein organisches Lösungsmittel ist, wird sie als Gelpermeationschromatographie bezeichnet.

Schritte

  • Die Säule ist mit semipermeablen, porösen Polymergelkügelchen mit einem genau definierten Bereich von Porengrößen gefüllt.
  • Die mit der mobilen Phase vermischte Probe wird dann vom Kopf der Säule in die Säule injiziert.
  • Die an die Säule gebundenen Moleküle werden durch Elutionslösung getrennt, wobei entweder eine Lösung gleicher Polarität verwendet wird (isokratische Technik) oder unterschiedliche Proben mit unterschiedlichen Polaritäten verwendet werden (Gradiententechnik).
  • Elutionsbedingungen (pH-Wert, essentielle Ionen, Cofaktoren, Proteaseinhibitoren usw.) können ausgewählt werden, die die Anforderungen des interessierenden Moleküls ergänzen.

Verwendet

  • Einer der Hauptvorteile der Gelfiltrationschromatographie besteht darin, dass die Trennung unter Bedingungen durchgeführt werden kann, die speziell darauf ausgelegt sind, die Stabilität und Aktivität des interessierenden Moleküls aufrechtzuerhalten, ohne die Auflösung zu beeinträchtigen.
  • Das Fehlen eines Molekülmatrix-Bindungsschritts verhindert auch eine unnötige Schädigung fragiler Moleküle, wodurch sichergestellt wird, dass Gelfiltrationstrennungen im Allgemeinen eine hohe Wiedergewinnung der Aktivität ergeben.
  • Aufgrund seiner einzigartigen Art der Trennung wurde die Gelfiltrationschromatographie erfolgreich bei der Reinigung von Proteinen und Peptiden aus verschiedenen Quellen eingesetzt.
  • Gelfiltrationschromatographie wurde verwendet, um verschiedene Nukleinsäurespezies wie DNA, RNA und tRNA sowie deren Basen, Adenin, Guanin, Thymin, Cytosin und Uracil, zu trennen.

Beispiele

  • Die Trennung des rekombinanten humanen Granulozytenkolonie-stimulierenden Faktors (rhG-CSF) von Einschlusskörpern in hoher Ausbeute durch Harnstoffgradienten-Größenausschlusschromatographie.
  • Die Trennung von Hühnerei-Lysozym unter Verwendung von Gelsäulen auf Acrylamid- und Dextran-Basis.

Hochleistungsflüssigchromatographie (HPLC)

Die Hochleistungsflüssigchromatographie ist eine modifizierte Form der Säulenchromatographie, bei der die Komponenten eines Gemisches aufgrund ihrer Affinität zur stationären Phase getrennt werden.

Prinzip der HPLC

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der differentiellen Adsorption, bei der verschiedene Moleküle in einem Gemisch einen unterschiedlichen Grad an Wechselwirkungen mit dem in der stationären Phase vorhandenen Absorptionsmittel aufweisen.
  • Die Moleküle mit höherer Affinität bleiben länger adsorbiert, wodurch ihre Bewegungsgeschwindigkeit durch die Säule verringert wird.
  • Die Moleküle mit geringerer Affinität bewegen sich jedoch mit einer schnelleren Bewegung, wodurch die Moleküle in verschiedenen Fraktionen getrennt werden können.
  • Dieser Vorgang unterscheidet sich geringfügig von der Säulenchromatographie wie in diesem Fall; Das Lösungsmittel wird unter hohen Drücken von bis zu 400 Atmosphären gezwungen, anstatt es unter der Schwerkraft abtropfen zu lassen.

Schritte der HPLC

  • Die Säule wird hergestellt, indem ein Glasrohr genommen wird, das getrocknet und mit einer dünnen, gleichmäßigen Schicht stationärer Phase (Cellulose, Siliciumdioxid) beschichtet wird.
  • Dann wird die Probe hergestellt, indem die Mischung der mobilen Phase zugesetzt wird. Die Probe wird von oben in die Säule eingeführt, und eine Hochdruckpumpe wird verwendet, um die Probe mit einer konstanten Geschwindigkeit zu fördern.
  • Die mobile Phase bewegt sich dann zu einem Detektor, der Moleküle bei einer bestimmten Absorptionswellenlänge detektiert.
  • Die abgetrennten Moleküle können für verschiedene Zwecke weiter analysiert werden.

Verwendung von HPLC

  • Hochleistungsflüssigchromatographie wird zur Analyse von Schadstoffen in Umweltproben verwendet.
  • Es wird durchgeführt, um die Produktreinheit und Qualitätskontrolle verschiedener Industrieproduktionen aufrechtzuerhalten.
  • Diese Technik kann auch verwendet werden, um verschiedene biologische Moleküle wie Proteine ​​und Nukleinsäuren zu trennen.
  • Die erhöhte Geschwindigkeit dieser Technik macht den Prozess schneller und effektiver.

Beispiel für HPLC

  • Hochleistungsflüssigchromatographie wurde durchgeführt, um die Wirksamkeit verschiedener Antikörper gegen Krankheiten wie Ebola zu testen.

Hydrophobe Wechselwirkungschromatographie

Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie ist die Trenntechnik, bei der Moleküle anhand ihres Hydrophobizitätsgrades getrennt werden.

Prinzip der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie

  • Das Prinzip der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie basiert auf der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen mit hydrophoben Gruppen.
  • Hier ist die stationäre Phase ein fester Träger, der sowohl mit hydrophoben als auch mit hydrophilen Gruppen aufgebracht wird.
  • Die Lösungsmittelmoleküle, die hydrophobe Regionen enthalten, interagieren mit den hydrophoben Gruppen und trennen sie so von den Molekülen mit hydrophilen Gruppen.
  • Die Wechselwirkung wird dann umgekehrt, indem eine Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten angewendet wird, wodurch die Moleküle mit hydrophoben Gruppen von der stationären Phase getrennt werden.

Schritte der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie

  • Die Säule wird mit einem Glasrohr hergestellt, das mit einem festen Träger wie Kieselgel aufgebracht ist, an das hydrophobe Gruppen wie Phenyl, Octylbutyl gebunden sind.
  • Die Probe wird durch Zugabe der Mischung zur mobilen Phase hergestellt.
  • Die Probe wird dann von oben in die Säule injiziert.
  • Die Moleküle mit hydrophoben Gruppen bilden eine Wechselwirkung mit den hydrophoben Gruppen der stationären Phase. Im Gegensatz dazu bewegen sich die Moleküle ohne solche Gruppen mit der mobilen Phase aus der Säule heraus.
  • Dann wird eine bestimmte Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten in die Säule geleitet, die die gebundenen Moleküle aus der stationären Phase entfernt.

Verwendung der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie

  • Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie ist äußerst wichtig für die Trennung von Proteinen mit hydrophoben Gruppen.
  • Diese Technik ist geeigneter als andere Methoden, da diese Technik zu minimalen Denaturierungsaktivitäten führt.
  • In ähnlicher Weise kann dieses Verfahren auch auf die Trennung anderer organischer Verbindungen mit hydrophoben Gruppen angewendet werden.
  • Dies ermöglicht die Trennung von hydrophilen und hydrophoben biologischen Molekülen voneinander.

Beispiel für eine hydrophobe Wechselwirkungschromatographie

  • Die Trennung von Pflanzenproteinen aus den Rohextrakten.

Ionenaustauschchromatographie

Die Ionenaustauschchromatographie ist die Trenntechnik für geladene Moleküle durch ihre Wechselwirkung mit der entgegengesetzt geladenen stationären Phase in Form eines Ionenaustauscherharzes.

Prinzip der Ionenaustauschchromatographie

  • Diese Technik basiert auf dem Prinzip der Anziehung von geladenem Harz und dem entgegengesetzt geladenen Analyten. Hier findet der Austausch von negativ / positiv geladenen Ionen statt, um die geladenen Moleküle zu entfernen.
  • Die stationäre Phase wird zuerst mit bestimmten Ladungen beschichtet, wobei die Komponenten der Mischung mit entgegengesetzten Ladungen binden.
  • Ein Kationen- oder Anionenaustauscherharz mit einer höheren Affinität zu den geladenen Komponenten bindet dann die Komponenten und verdrängt das entgegengesetzt geladene Harz.
  • Der Kationen- oder Anionenaustauscherharz-Komponenten-Komplex wird dann unter Verwendung verschiedener Puffer entfernt.

Schritte der Ionenaustauschchromatographie

  • Eine mit geladenem Harz gepackte Säule, die entweder positiv oder negativ geladen sein kann, wird als stationäre Phase genommen.
  • Die Mischung mit den geladenen Teilchen wird dann durch die Säule geleitet, wo die geladenen Moleküle an die entgegengesetzt geladenen Harze binden.
  • Wenn ein Kationenaustauscherharz verwendet wird, binden die positiv geladenen Moleküle nun an das Kationenaustauscherharz und verdrängen das negativ geladene Harz.
  • In ähnlicher Weise binden, wenn ein Anionenaustauscherharz verwendet wird, die negativ geladenen Moleküle an das Anionenaustauscherharz und verdrängen das positiv geladene Harz.
  • Nun wird ein geeigneter Puffer auf die Säule aufgebracht, um den Komplex aus geladenen Austauschharzen und den geladenen Molekülen zu trennen.

Verwendung der Ionenaustauschchromatographie

  • Ionenaustauschchromatographie wird bei der Reinigung von Wasser verwendet, wobei die positiv geladenen Ionen durch Wasserstoffionen und die negativ geladenen Ionen durch Hydroxylionen ersetzt werden.
  • Diese Methode eignet sich auch als wirksame Methode zur Analyse der nach der Hydrolyse von Nukleinsäuren gebildeten Produkte.
  • Die Trennung von Metallen und anderen anorganischen Verbindungen wird auch durch die Ionenaustauschchromatographie erleichtert.

Beispiele für Ionenaustauschchromatographie

  • Die Trennung positiv geladener Lanthanoidionen aus der Erdkruste.
  • Die Trennung von Proteinen aus der aus dem Blutserum erhaltenen Rohmischung.

Flüssigkeitschromatographie

Die Flüssigkeitschromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die verwendete mobile Phase flüssig ist und die Trennung entweder in einer Säule oder auf einer ebenen Oberfläche erfolgen kann.

Prinzip der Flüssigkeitschromatographie

  • Der Prozess der Flüssigkeitschromatographie basiert auf dem Prinzip der Affinität der Moleküle zur mobilen Phase.
  • Wenn die zu trennenden Komponenten eine höhere Affinität zur mobilen Phase aufweisen, bewegen sich die Moleküle zusammen mit der mobilen Phase und verlassen die Säule schneller.
  • Wenn die Komponenten jedoch einen geringeren Grad an Wechselwirkung mit der mobilen Phase aufweisen, bewegen sich die Moleküle langsam und treten später aus der Säule aus.
  • Wenn also zwei Moleküle in einem Gemisch unterschiedliche Polaritäten haben und die mobile Phase eine unterschiedliche Polarität aufweist, bewegen sich die beiden Moleküle mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch die stationäre Phase.

Schritte der Flüssigkeitschromatographie

  • Die Säule oder das Papier wird dort hergestellt, wo die stationäre Phase (Cellulose oder Siliciumdioxid) auf den festen Träger aufgebracht wird.
  • Die Probe wird zu der flüssigen mobilen Phase gegeben, die dann in das Chromatographiesystem injiziert wird.
  • Die mobile Phase bewegt sich durch die stationäre Phase, bevor sie aus der Säule oder dem Rand des Papiers austritt.
  • Eine Elutionslösung wird auf das System aufgebracht, um die Moleküle von der stationären Phase zu trennen.

Verwendung der Flüssigkeitschromatographie

  • Die Flüssigkeitschromatographie ist eine wirksame Methode zur Trennung einer gefärbten Lösung, da sie nach der Trennung zwei getrennte Banden bildet.
  • Diese Methode kann auch gegenüber anderen Techniken angewendet werden, da sie recht einfach und kostengünstiger ist.
  • Es kann zur Trennung von festen Molekülen verwendet werden, die in Wasser unlöslich sind.

Beispiele für Flüssigkeitschromatographie

  • Die Hochleistungsflüssigchromatographie ist eine modifizierte Form der Flüssigkeitschromatographie, die in der Forschung zu biologischen Molekülen verwendet wird.

Papierchromatographie Die Papierchromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die Trennung auf einem Spezialpapier durchgeführt wird.

Prinzip der Papierchromatographie

  • Es gibt zwei Arten der Papierchromatographie, die auf zwei unterschiedlichen Prinzipien beruhen.
  • Die erste ist die Papieradsorptionschromatographie, die auf dem unterschiedlichen Grad der Wechselwirkung zwischen den Molekülen und der stationären Phase basiert.
  • Die Moleküle mit höherer Affinität bleiben länger adsorbiert, wodurch ihre Bewegungsgeschwindigkeit durch die Säule verringert wird.
  • Die Moleküle mit geringerer Affinität bewegen sich jedoch mit einer schnelleren Bewegung, wodurch die Moleküle in verschiedenen Fraktionen getrennt werden können.
  • Die zweite Art der Papierchromatographie ist die Papierpartitionschromatographie. Es basiert auf dem Prinzip, dass die Feuchtigkeit auf dem Cellulosepapier als stationäre Phase für die Moleküle wirkt, die sich mit der mobilen Phase bewegen.
  • Die Trennung der Moleküle basiert somit darauf, wie stark sie an der stationären Phase adsorbieren.
  • Ein zusätzliches Konzept des “Retentionsfaktors” wird bei der Trennung von Molekülen in der Papierchromatographie angewendet.
  • Der Retentionswert für ein Molekül wird als Verhältnis der vom Molekül zurückgelegten Strecke zur von der mobilen Phase zurückgelegten Strecke bestimmt.
  • Der Retentionswert verschiedener Moleküle kann verwendet werden, um diese Moleküle zu unterscheiden.

Schritte der Papierchromatographie

  • Die stationäre Phase wird als feines Zellulosepapier ausgewählt.
  • Als mobile Phase werden verschiedene Kombinationen von organischen und anorganischen Lösungsmitteln verwendet.
  • Etwa 2 bis 200 ul der Probenlösung werden an der Basislinie des Papiers injiziert und an der Luft trocknen gelassen.
  • Das mit der Probe beladene Papier wird dann vorsichtig nicht mehr als 1 cm hoch in die mobile Phase getaucht.
  • Nachdem die mobile Phase nahe dem Rand des Papiers erreicht ist, wird das Papier herausgenommen.
  • Der Retentionsfaktor wird berechnet und die getrennten Komponenten werden durch verschiedene Techniken erfasst.

Verwendung der Papierchromatographie

  • Papierchromatographie wird durchgeführt, um die Reinheit verschiedener pharmazeutischer Produkte festzustellen.
  • Es kann auch verwendet werden, um Kontaminationen in verschiedenen Proben wie Lebensmitteln und Getränken festzustellen.
  • Dieses Verfahren kann auch zur Abtrennung von Verunreinigungen aus verschiedenen Industrieprodukten eingesetzt werden.
  • Die Analyse der Reaktionsmischungen in Chemielabors erfolgt ebenfalls mittels Papierchromatographie.

Beispiele für Papierchromatographie

  • Die Papierchromatographie wird zur Trennung von Tintenmischungen oder anderen farbigen Getränken verwendet.

Umkehrphasenchromatographie

Die Umkehrphasenchromatographie ist eine Flüssigchromatographietechnik, bei der die Trennung von Molekülen durch hydrophobe Wechselwirkung zwischen der flüssigen mobilen Phase und der stationären Phase erreicht wird.

Prinzip der Umkehrphasenchromatographie

  • Das Prinzip der Umkehrphasenchromatographie basiert auf der Wechselwirkung zwischen zwei Molekülen mit hydrophoben Gruppen.
  • Hier ist die stationäre Phase ein fester Träger, der sowohl mit hydrophoben als auch mit hydrophilen Gruppen aufgebracht wird.
  • Die Lösungsmittelmoleküle, die hydrophobe Regionen enthalten, interagieren mit den hydrophoben Gruppen und trennen sie so von den Molekülen mit hydrophilen Gruppen.
  • Die Wechselwirkung wird dann umgekehrt, indem eine Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten angewendet wird, wodurch die Moleküle mit hydrophoben Gruppen von der stationären Phase getrennt werden.

Schritte der Umkehrphasenchromatographie

  • Die Säule wird mit einem Glasrohr hergestellt, das mit einem festen Träger wie Kieselgel aufgebracht ist, an das hydrophobe Gruppen wie Phenyl, Octylbutyl gebunden sind.
  • Die Probe wird hergestellt, indem die Mischung der mobilen Phase von organischen und anorganischen Lösungsmitteln zugesetzt wird.
  • Die Probe wird dann von oben in die Säule injiziert.
  • Die Moleküle mit hydrophoben Gruppen bilden eine Wechselwirkung mit den hydrophoben Gruppen der stationären Phase. Im Gegensatz dazu bewegen sich die Moleküle ohne solche Gruppen mit der mobilen Phase aus der Säule heraus.
  • Dann wird eine bestimmte Elutionslösung mit abnehmendem Salzgradienten in die Säule geleitet, die die gebundenen Moleküle aus der stationären Phase entfernt.

Verwendung der Umkehrphasenchromatographie

  • Die Umkehrchromatographie wird in Kombination mit der Hochleistungsflüssigchromatographie zunehmend zur Trennung von Biomolekülen eingesetzt.
  • Dies wird auch bei der Untersuchung der Analyse von Arzneimitteln, Metaboliten und aktiven Molekülen verwendet.
  • Es kann auch verwendet werden, um Verunreinigungen aus verschiedenen Umweltproben zu entfernen.

Beispiele für die Umkehrphasenchromatographie

  • Die hydrophobe Wechselwirkungschromatographie ist ein Beispiel für die Umkehrphasenchromatographie, bei der diese Technik verwendet wird, um Proteine ​​von ihren Gemischen zu trennen.

Dünnschichtchromatographie (DC)

Die Dünnschichtchromatographie ist eine Trenntechnik, bei der die stationäre Phase als dünne Schicht auf eine feste Trägerplatte mit einer flüssigen mobilen Phase aufgebracht wird.

Prinzip der Dünnschichtchromatographie (DC)

  • Diese Chromatographietechnik basiert auf dem Prinzip, dass Komponenten eines Gemisches getrennt werden, wenn die Komponente mit einer Affinität zur stationären Phase an die stationäre Phase bindet. Im Gegensatz dazu werden andere Komponenten mit der mobilen Phase eluiert.
  • Das Substrat / Ligand ist an die stationäre Phase gebunden, so dass die reaktiven Stellen für die Bindung von Komponenten freigelegt werden.
  • Nun wird die Mischung durch die mobile Phase geleitet, wo die Komponenten mit Bindungsstellen für das Substrat an das Substrat in der stationären Phase binden, während der Rest der Komponenten mit der mobilen Phase eluiert wird.
  • Nach der Trennung werden die Moleküle als Flecken an einer anderen Stelle während der stationären Phase gesehen.
  • Der Nachweis von Molekülen erfolgt mit verschiedenen Techniken.

Schritte der Dünnschichtchromatographie (DC)

  • Die stationäre Phase wird gleichmäßig auf den festen Träger (Glas, dünne Platte oder Aluminiumfolie) aufgetragen und getrocknet.
  • Die Probe wird als Flecken auf der stationären Phase etwa 1 cm über dem Rand der Platte injiziert.
  • Die mit Probe beladene Platte wird dann vorsichtig nicht mehr als 1 cm hoch in die mobile Phase getaucht.
  • Nachdem die mobile Phase nahe dem Rand der Platte erreicht ist, wird die Platte herausgenommen.
  • Der Retentionsfaktor wird wie bei der Papierchromatographie berechnet und die getrennten Komponenten werden durch verschiedene Techniken nachgewiesen.

Verwendung der Dünnschichtchromatographie (DC)

  • Die Dünnschichtchromatographie wird routinemäßig in Laboratorien durchgeführt, um verschiedene Substanzen zu identifizieren, die in einer Mischung vorhanden sind.
  • Diese Technik hilft bei der Analyse von Fasern in der Forensik.
  • DC ermöglicht auch den Assay verschiedener pharmazeutischer Produkte.
  • Es hilft bei der Identifizierung von Heilpflanzen und ihrer Zusammensetzung.

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