Was ist Agrobakterium ? Faktoren

Was ist Agrobakterium ?

Was ist Agrobakterium ?Agrobacterium ist ein Phytopathogen, das Pflanzen durch Wundstellen infiziert und Kronengallenkrankheiten verursacht, und ist eines der beliebtesten Werkzeuge zur Pflanzentransformation, die bis heute in der Landwirtschaft verwendet werden.

  • Agrobacterium tumefaciens ist der Bodenpathogen, der sein bakterielles Typ-IV-Sekretionssystem für den Transfer seiner übertragenen (T)-DNA in die Wirtszellen nutzt.
  • Die Gattung Agrobacterium besteht je nach Krankheitssymptomatik und Wirtsspektrum aus verschiedenen Arten. Einige der Arten von Agrobacterium umfassen A . radiobacter, A. vitis, A. rhizogenes, A. rubi und A. tumefaciens .
  • Die Organismen dieser Gattung sind vor allem als Werkzeuge zur Pflanzentransformation bekannt, die in einer Vielzahl von Wirtszellen verwendet werden.
  • Das Wirtsspektrum der Bakterien wird durch verschiedene bakterielle sowie pflanzliche Faktoren bestimmt. Bakterielle Faktoren umfassen Virulenzgene und T-DNA-Onkogene, wohingegen die Pflanzenfaktoren Gene umfassen, die für die Transformation und Tumorbildung benötigt werden.
  • Die natürliche Diversität der Bakterien wird anhand des Vorhandenseins der primären pathogenen Determinante, des Ti/Ri-Plasmids, bestimmt.
  • Verschiedene Stämme von Agrobacterium können aus der ganzen Welt in einer Vielzahl von Wirtspflanzen isoliert werden. Einige der häufigsten Wirtspflanzen sind Rosen, Pappeln, Trauerfeigen, Chrysanthemen und andere Obstbäume.
  • Das Vorhandensein verschiedener Plasmide und die Fähigkeit des Organismus, einen DNA-Abschnitt mit dem tumorinduzierenden Plasmid in das Genom der Wirtszelle zu übertragen, ist der primäre Faktor für den Einsatz von Agrobacterium bei der Pflanzentransformation.
  • Agrobacterium ist ein gramnegatives stäbchenförmiges Bakterium mit einer Größe von 1,5 bis 3 µm Länge und 0,6 bis 1,0 µm Breite. Das Bakterium ist mit einer oder bis zu sechs Geißeln beweglich.
  • Diese bilden keine Sporen und sind streng aerobe, im Boden lebende Organismen mit klinischer sowie biotechnologischer Anwendung.

Faktoren, die den  Agrobacterium- vermittelten Gentransfer beeinflussen

  • Es gibt eine Reihe von Verfahren, die verwendet werden, um transgene Pflanzen zu erhalten, von denen einige Agrobacterium- vermittelte Transformation, Partikelbombardierung, durch Polyethylenglycol vermittelte Protoplasten und Liposom-vermittelte Transformation umfassen.
  • Unter all diesen Verfahren führt die Agrobacterium- vermittelte Transformation zu Single-Copy-Transgenen, die vergleichsweise stabiler exprimiert werden als multiple Genkopien.
  • Der Prozess wird jedoch von verschiedenen Faktoren wie Bakterienstämmen und Zelldichte, Pflanzenarten, Pflanzenwachstumsregulatoren und Umweltfaktoren beeinflusst.
  • Um ein effizientes Transformationsprotokoll zu entwickeln, ist es notwendig, die richtige Kombination dieser Faktoren zu finden.

Im Folgenden sind einige der Faktoren aufgeführt, die die Agrobacterium- vermittelte Transformation beeinflussen;

A. Explantate

  • Explantate sind Zielmaterial für die Agrobacterium- vermittelte Transformation, die embryonale Kulturen, unreife Embryonen, reife Samenderivate , Blattspreite und sogar Stängelsegmente sein können.
  • Die Auswahl der Explantate sollte so erfolgen, dass die Gewinnung der gesamten transgenen Pflanze gewährleistet ist.
  • Es wurden verschiedene Studien durchgeführt, um die besten Explantate für einen effizienten Transformationsprozess zu bestimmen.
  • Embryonaler Callus, der aus reifen Samen gewonnen wird, gilt als eines der besten Explantate für die Agrobacterium- vermittelte Transformation bei bestimmten Pflanzenarten.
  • Es wurde entdeckt, dass einer der wesentlichen Faktoren, die die Transformation verstärken, die Austrocknung von Explantaten vor oder nach einer Agrobacterium- Infektion ist.
  • Die Unterschiede in der Effizienz der Transformation auf verschiedenen Pflanzengeweben wurden auf die Unterschiede in der Fähigkeit der Bakterien, sich an die Pflanzenzellen anzuheften, und den Unterschieden im T-DNA-Transfermechanismus zugeschrieben.

B. Explantate Wunde

  • Die Verwundung von Explantaten ist für die effiziente Agrobacterium- vermittelte Transformation erforderlich .
  • Die Art und Methode der Verwundung kann von einfachen Wunden während der Explantatpräparation bis hin zu durch Partikelpistolen vermittelten Mikrowunden reichen.
  • Es gibt andere Formen der Verwundung, die mit Agrobacterium gefüllte Spritzen und Beschallung umfassen.
  • Die Transformation wird auch durch die Bildung von Mikrowunden an der Oberfläche und unter der Oberfläche des Zielgewebes verbessert, was zur Freisetzung von Phenolverbindungen führt.
  • Die Effizienz der Transformation hängt auch von der Anwendung zusätzlicher phenolischer Substanzen ab.

C. Pflanzenarten und Genotyp

  • Die Unterschiede in der Effizienz der Agrobacterium- vermittelten Transformation in verschiedenen Pflanzenarten sind auf die Unterschiede in den Induktormolekülen zurückzuführen.
  • Der Erfolg der Transformation hängt von den Chromosomen- und Plasmidgenomen ab, die alle für die Anheftung und den DNA-Transfer erforderlichen Materialien kodieren.
  • Verschiedene Pflanzen haben unterschiedliche Niveaus der vir-Genexpression in verschiedenen Wirten, was die Empfindlichkeit gegenüber einer Infektion durch Agrobacterium beeinflusst .
  • Sogar innerhalb derselben Art zeigen mehrere Sorten oder Ökotypen unterschiedliche Anfälligkeit für Tumorentstehung durch Agrobacterium- Arten.
  • Die meisten der Agrobacterium- vermittelten Transformationen werden an zweikeimblättrigen Arten durchgeführt, aber in jüngerer Zeit hat die Häufigkeit des Gentransfers in einkeimblättrige Arten zugenommen.

D. Antibiotika

  • Während der Transformation folgt auf die Cokultivierung die Unterdrückung von Bakterien, um das Wachstum und die Entwicklung der Wirtspflanze nicht zu stören.
  • Die Elimination der Bakterien wird durch die Verwendung eines oder mehrerer Antibiotika im Kulturmedium erreicht.
  • Einige der am häufigsten verwendeten Antibiotika sind Carbenicillin und Cefotaxim. Die Art der verwendeten Antibiotika hängt auch von der Pflanzenart und den Agrobacterium- Stämmen ab.
  • Es ist wichtig, das richtige Antibiotikaverhältnis zu bestimmen, um eine Antibiotikaselektion und eine angemessene Tumorentstehungsrate zu erreichen.

e. Pflanzenwachstumsregulatoren (PGR)

  • Die Pflanzentransformation erfordert auch die Zugabe von Pflanzenwachstumsregulatoren, und die richtige Wahl der Regulatoren ist einer der wichtigsten Faktoren, die den Prozess beeinflussen.
  • Die Kompetenz und Anfälligkeit für eine Agrobacterium- Infektion bei widerspenstigen Explantaten ist ohne PGR-Behandlungen entweder gering oder fehlt.
  • Es ist bekannt, dass die Anwesenheit von 2,4-D im Wachstumsmedium während des Cokultivierungsprozesses die Transformationseffizienz erhöht.
  • Die Verwendung von Wachstumsregulatoren erleichtert die Zellteilung und -differenzierung in vielen Geweben; die Verwendung von Regulatoren sollte jedoch in einem bestimmten Stadium des Pflanzenzellzyklus erfolgen.

F. Hell

  • Licht ist ein wichtiger Faktor, der die Effizienz der Agrobacterium- vermittelten Transformation beeinflusst, da Licht verschiedene physiologische Faktoren in der Pflanze beeinflusst, wie den Pflanzenhormonspiegel, die Zellproliferation und das Zellzyklusstadium.
  • Es ist auch bekannt, dass Licht die Menge des phenolischen vir-Geninduktors erhöht, was den Transformationsprozess beeinflusst, da es den T-DNA-Transfer reguliert.
  • Verschiedene Agrobacterium- vermittelte Transformationsverfahren verwenden dunkle Co-Kulturbedingungen, um die Morphologie der Explantate zu verbessern.
  • Einige Studien haben auch gezeigt, dass die Wirkung von Licht auf den Prozess hauptsächlich auf der Photoperiode beruht.

g. Temperatur

  • Frühe Studien, die sich auf die Effizienz der Agrobacterium- vermittelten Transformation beziehen, zeigen, dass hohe Temperaturen schädlich für die Tumorentwicklung waren.
  • Es ist bekannt, dass eine Temperatur von etwa 32 °C die Tumorentwicklung aufgrund von Konformationsänderungen in den virA-Genen unterdrückt. Die optimale Temperatur für den Transfer von T-DNA wurde mit 19°C ermittelt.
  • Die optimale Temperatur für die Übertragung kann bei verschiedenen Arten unterschiedlich sein, aber der Temperaturbereich von 19°C bis 22°C wurde für viele Pflanzenarten als ideal angesehen.

h. Agrobakterien- Stämme

  • Die Infektionsfähigkeit verschiedener Agrobacterium- Stämme ist je nach Anwesenheit verschiedener Plasmide unterschiedlich.
  • Die effizienteste Bakteriengruppe, die für die Transformation verwendet wird, ist die Kombination eines binären Standardvektors in einem supervirulenten Stamm und eines superbinären Vektors in einem regulären Stamm.
  • Verschiedene Kombinationen von Agrobacterium- Stämmen könnten für verschiedene Arten von Pflanzenzellen verwendet werden. 

Prinzip des Agrobacterium- vermittelten Gentransfers

  • Grundlage der Agrobacterium- vermittelten Transformation ist die Fähigkeit des Organismus, seine T-DNA effizient in die Wirtszellen zu übertragen.
  • Die Biologie des Prozesses besteht aus zwei Komponenten; die T-DNA besteht aus 25 bp-Wiederholungen, die an der T-Region und der Virulenz-(vir)-Region enden, die aus sieben Hauptloci besteht.
  • Der Mechanismus der Agrobacterium- vermittelten Transformation beruht auf der Übertragung eines Plasmidstücks durch die Bakterien in die Pflanzenzellen während der Infektion.
  • Das Plasmid integriert sich dann in das Kerngenom, um seine eigenen Gene zu exprimieren und den Hormonhaushalt in der Wirtszelle zu beeinflussen.
  • Außerdem produzieren die Bakterien auch eine Reihe von Enzymen, die an der Synthese von Opinen beteiligt sind, die dann von den Bakterien als Nährstoffe verwendet werden.
  • Einige der wesentlichen Bestandteile der an der Infektion beteiligten Bakterien sind T-DNA, die auf dem Plasmid namens Ti (tumorinduzierendes) Plasmid vorhanden ist, zusammen mit anderen funktionellen Komponenten wie Virulenz (vir), Konjugation (con) und Replikationsursprung (ori). .
  • Die Infektion beginnt mit dem Eindringen der Bakterien durch verwundete Stellen. Die Bindung von Bakterien an die Pflanzenzellen wird durch die Freisetzung von phenolischem Acetosyringon (AS) durch die verletzten Pflanzenzellen verstärkt.
  • Das AS aktiviert die VirA-Proteine ​​auf den Bakterien, die VirG durch Phosphorylierung seines Aspartatrestes aktivieren.
  • Die aktivierte Form von VirG bindet dann an andere vir-Gene und induziert deren Expression. Durch diesen Prozess aktiviertes VirD stimuliert die T-Strang-Erzeugung (eine einzelsträngige Kopie der T-DNA).
  • Das VirD2 bindet kovalent an das 5′-Ende des T-Strangs, da das 5′-Ende während des Transfers das führende Ende ist. Andere Faktoren wie VirE2- und VirB-Proteine ​​binden ebenfalls an den T-Strang und bilden einen T-Komplex.
  • Der Komplex wird dann durch die nuklearen Zielsignale, die von den Vir-Proteinen freigesetzt werden, in den Kern geleitet. Der T-DNA-Strang wird zufällig entweder als Einzelkopie oder als Mehrfachkopie in das Pflanzengenom integriert.
  • Die Integration erfolgt üblicherweise in den transkriptionsaktiven oder repetitiven Regionen des Genoms durch den Prozess der Rekombination.
  • Obwohl viel über die Molekularbiologie des T-DNA-Transfers in Agrobacterium- Zellen bekannt ist, ist nicht viel über die pflanzenkodierten Faktoren bekannt, die an diesem Prozess beteiligt sind.

Anforderungen (Materialien und Reagenzien)

Materialien/ Ausrüstung

  • Sterile 50 ml Kunststoffröhrchen
  • Autoklav
  • Kontrollierte Gewebekulturräume bei 25 °C mit 16/8 Stunden Hell-/Dunkelperiode
  • Schüttel-Inkubator
  • Vakuumpumpe
  • Laminarhaube für Gewebekultur
  • Glaswaren (Becher, Zylinder, Petrischalen, Duran-Flaschen und Flasks)
  • Filterpapier
  • Parafilm
  • Pinzette und Skalpell
  • Pipetten
  • Zentrifuge
  • Spektrophotometer
  • Gewebekulturgefäße
  • Chirurgische Klingen

Reagenzien

  • Explantation (Stämme, Embryo, Keimblätter oder andere Gewebe)
  • Agrobacterium- Stamm
  • 13% Natriumhypochlorit
  • B5 Mittel
  • So dass
  • Trypton
  • Hefeextrakt
  • Natriumchlorid
  • 35% Salzsäure
  • Steriles destilliertes Wasser
  • 75% Ethanol
  • Saccharose
  • Abscisinsäure
  • Rifampicin
  • Kanamycinmonosulfat
  • Gellan-Schießpulver
  • PCR-Primer-Stern-Mix
  • Carbenicillin-Dinatriumsalz

Medienvorbereitung für den Agrobacterium- vermittelten Gentransfer

A. LB-Medium für Agrobacterium- Kultur

  • 5 Gramm Hefeextrakt, 10 Gramm Trypton und 5 Gramm Natriumchlorid werden in 1 Liter destilliertem Wasser gelöst.
  • Zu 50 ml des LB-Mediums werden 50 ul 100 mg/ml Rifampicin-Stammlösung und 50 ul 50 mg/ml Kanamycin-Stammlösung zugegeben.

B. Murashige- und Skoog-Medium für die Samenkeimung

  • 4,43 g Murashige und Skoog basal medium power und 3 g Saccharose werden zu 1 Liter destilliertem Wasser gegeben. 
  • Dazu werden 2,5 g Gellan-Schießpulver hinzugefügt und autoklaviert. 25 ml dieses Mediums werden unter Laminarflow auf Petriplatten gegossen.

C. Cokultivierungsmedium

  • Dem Murashige- und Skoog-Basalmedium werden 750 ul 2 mg/ml BAP zugesetzt. Wieder werden dem Medium 500 ul 2 mg/ml ABA zugesetzt.
  • 25 ml des Mediums werden im Laminarflow auf sterile Petrischalen gegossen.

D. Aufnahmemedium

  • Shooting-Medium wird durch Zugabe von 50 ul 50 mg/ml Kanamycin und 2,5 ml 200 mg/ml Carbenicillin zum Cokultivierungsmedium hergestellt.

e. Wurzelmedium

  • Bewurzelungsmedium wird durch Zugabe von 50 ul 50 mg/ml Kanamycin und 1 ml 200 mg/ml Carbenicillin hergestellt. 

Verfahren oder Protokoll des Agrobacterium- vermittelten Gentransfers

Das Protokoll oder Verfahren für die Agrobacterium- vermittelte Transformation kann je nach Art der für das Verfahren ausgewählten Explantate unterschiedlich sein. Das Folgende ist das Protokoll für die Agrobacterium- vermittelte Transformation im Fall eines Embryos;

A. Sterilisation und Keimung von Samen

  • Die Samen werden 1-2 Stunden mit Cl 2 sterilisiert und dann werden die Samen 2 Stunden bei Raumtemperatur in einer Petrischale in Wasser eingeweicht.
  • Die Samenhüllen werden mit einer Pinzette vom Samen entfernt und mit 75 % Ethanol für 30 Sekunden weiter sterilisiert. Diese werden dann mit 20 ml des 3% Natriumhypochlorits gespült.
  • Die sterilisierten Samen werden auf Petriplatten, die Samenkeimungsmedium enthalten, gegeben und bei 28°C für 2 Tage im Dunkeln inkubiert. Jeder Teller kann etwa 15-25 Samen enthalten.

B. Vorbereitung des Inokulums

  • 2 ml des LB-Mediums, das Rifampicin und Kanamycin enthält, wird mit einer einzelnen Agrobacterium- Kolonie beimpft . Die Kultur wird dann im Schüttelinkubator bei 28°C inkubiert.
  • Die hergestellte Agrobacterium- Kultur wird 10 Minuten bei 4000 g zentrifugiert. Der Überstand wird entfernt und die Pellets werden mit 1 ml MS-Flüssigmedium gereinigt.

C. Vorbereitung der Explantate

  • Die Samen werden aus dem Keimmedium gezogen und auf leere sterile Petrischalen mit einem Stapel Filterpapiere gelegt.
  • Die Keimwurzel wird entfernt und der Samen wird geschnitten, um die Hälfte der Keimblätter und Endopleura zu entfernen.
  • Die Keimblätter werden mit einem sterilen Skalpell abgetrennt und abgewischt. Die abgelösten Keimblätter werden in einem sterilen Becherglas in das MS-Flüssigmedium gesammelt.
  • Das die Keimblätter enthaltende MS-Flüssigmedium wird in das Agrobacterium enthaltende MS-Flüssigmedium gegossen und vorsichtig geschüttelt.
  • Das Becherglas wird mit einem Behälter abgedeckt und mit Folie verschlossen und in die Exsikkatoren der Vakuumpumpe gesteckt.
  • Die Explantate werden nach zwei Sitzungen der Vakuuminfiltration 5 Minuten auf dem Medium belassen.
  • Auf das Cokultivierungsmedium wird ein steriles Filterpapier gepackt und die infizierten Explantate mit einer Pinzette auf das Filterpapier gelegt. Die adaxiale Fläche des Keimblattes ist nach oben zu halten.
  • Die Petriplatten werden dann verschlossen und 2 Tage im Dunkeln bei 28°C inkubiert.

D. Aufnahmeeinleitung

  • Die Explantate werden dann auf das Kanamycin und Carbenicillin enthaltende Schussmedium übertragen, um das Wachstum von Agrobacterium zu hemmen .
  • Jede Platte kann 5-6 Explantate enthalten, die dann 2-3 Wochen bei 25°C unter Licht inkubiert werden.

e. Regeneration

  • Sobald die Triebe auf den Explantaten erscheinen, werden diese herausgezogen und mit einem Stapel Filterpapier auf sterile Petriplatten gelegt.
  • Die Triebe werden mit einem sterilen Skalpell abgeschnitten und der embryoide Teil der Triebe entfernt.
  • Die Sprosse werden dann in einen 100 ml Glaskolben oder Gewebekulturgefäße mit einem Bewurzelungsmedium überführt.
  • Pro Gefäß können ca. 3-4 Triebe hinzugefügt werden. Die Gefäße werden 1-2 Wochen bei 25°C unter Licht inkubiert.
  • Wenn nach 2 Wochen keine Wurzeln beobachtet werden, werden die entfalteten Blätter und Endteile der Triebe abgeschnitten und die Triebe werden in ein neues Wurzelmedium überführt.

F. Pflanzenakklimatisierung

  • Nachdem die Wurzeln zu erscheinen beginnen, werden die Überstände der Kolben gelöst und weitere 3 Tage bei 25°C inkubiert.
  • Anschließend werden die Pflanzen aus dem Medium gezogen und mit fließendem Wasser abgewaschen.
  • Diese werden dann in mit nassem Kompost gefüllte Töpfe umgefüllt und bewässert.
  • Die Töpfe sind mit Reißverschlussbeuteln bedeckt, um die Feuchtigkeit zu halten. Diese werden in einer Kammer mit gutem Zustand unter Licht bei 25 °C für 1-2 Wochen inkubiert.
  • Sobald die Pflanzen in gutem Zustand wachsen, werden die Reißverschlussbeutel entfernt und die Pflanzen werden bewässert.

Anwendungen des Agrobacterium- vermittelten Gentransfers

Das Folgende sind einige der wichtigen Anwendungen der Agrobacterium- vermittelten Transformation;

  1. Die Agrobacterium-vermittelte Transformation wurde als Methode zur genetischen Veränderung von Pflanzen zur Herstellung verschiedener Substanzen wie Proteine, Antikörper und sogar Impfstoffe verwendet.
  2. Verschiedene Pflanzen wurden auch modifiziert, um lebensrettende pharmazeutische Produkte wie Antikoagulanzien, humane epidermale Wachstumsfaktoren und Interferone herzustellen.
  3. Mit Agrobacterium präparierte transgene Pflanzen dienen als Biomonitor zum Nachweis giftiger Stoffe in der Umwelt sowie zur Entgiftung des kontaminierten Bodens und Wassers.
  4. Die Agrobacterium- vermittelte Transformation hat auch die Ernteerträge durch Modifizierung der Haltbarkeit und Biosynthese der Pflanzen bemerkenswert erhöht.
  5. Pflanzen können modifiziert werden, um die Toleranz gegenüber biotischen und abiotischen Faktoren zu erhöhen, die Nährstoffaufnahme mit erhöhter Schädlingsresistenz.
  6. Die Agrobacterium- vermittelte Transformation wurde verwendet, um Insektenresistenz-Pflanzen durch den Einbau verschiedener toxischer Gene wie der Bt-Toxin-Gene zu erzeugen.
  7. Die Zunahme der Schädlingsresistenz führt zu einer Reduzierung des Einsatzes von schädlichen Agrochemikalien und Herbiziden.
  8. Die Agrobacterium- vermittelte Transformation ist eine der weniger komplizierten gentechnischen Techniken, die auch für andere Organismen aufgerüstet werden kann. 

Grenzen des Agrobacterium- vermittelten Gentransfers

Obwohl die Agrobacterium- vermittelte Transformation im Laufe der Jahre mit großem Erfolg vorangekommen ist, gibt es einige Probleme und Einschränkungen, die mit dieser Technik verbunden sind. Einige der häufig auftretenden Einschränkungen und Probleme mit der Technik sind:

  1. Die wichtigste mit dieser Technik verbundene Einschränkung ist das enge Wirtsspektrum, da es immer noch auf bestimmte Pflanzenarten beschränkt ist.
  2. Obwohl viel über den Mechanismus des T-DNA-Transfers in den Bakterien bekannt ist, ist nicht viel über die pflanzenkodierten Faktoren bekannt, die die Effizienz dieses Prozesses beeinflussen.
  3. Die Technik ist arbeitsintensiv, da sie die Entwicklung von Pflanzenregenerationsprotokollen und detaillierten zeitaufwändigen Prozessen erfordert. Viele dieser Prozesse sind anfällig für In-vitro-Variationen, die zu ungünstigen Ergebnissen führen.
  4. Der Erfolg der Transformation bei Monokotyledonen hängt von der Verwendung von Embryonen als Explantate ab; diese stehen jedoch nur für kurze Zeit im Jahr zur Verfügung.
  5. Die Agrobacterium- vermittelte Transformation kann große DNA-Moleküle nicht in wirtschaftlich wichtigere Pflanzen übertragen, was auf eine mögliche Einführung eines leistungsfähigen Vektorsystems hinweist.

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